外源性IL-18基因对大鼠C6胶质瘤细胞生物学特性及化疗敏感性影响.pdf

中文摘要 外源性lL一18基因对大鼠C6胶质瘤细胞生物学 特性及化疗敏感性的影晌 摘 要 研究表明，癌基因扩增、抑癌基因失活及细胞周期调控基因表达异常 与胶质瘤的发生、发展及胶质瘤的恶性程度和预后有关。近年来，随着分 子生物学研究不断深入，在胶质瘤基因治疗方而取得r…定的进步，有的 方法已经进入临床试验阶段或应用于临床，为胶质瘤的基因治疗提供了… 条新途径。细胞因子是一类具有介导和调节免疫炎症反应等多种生物学活 性的小分子可溶性蛋白质，通过自分泌或旁分泌方式作用于分泌细胞本身 或其它细胞。它们主要由淋巴细胞、单核巨噬细胞等细胞产生，一些肿瘤 细胞也可产生某些细胞因子。细胞因子失调是免疫系统不能有效杀灭肿瘤 细胞的重要原因之一。IL．18(interleukin—l8)是新近发现的一种细胞因子， 具有多种生物学活性，可激活T细胞、NK细胞，使Thl、NK细胞产生INF—Y。 在T细胞或NK细胞存在的情况下，体内、外研究均证实IL一18有抗肿瘤作 用。有研究报道在体外没有T细胞、Ⅻ(细胞存在的情况下，IL．18也可诱 8 导肿瘤细胞凋亡；在体内用抗NK细胞或INF—Y抗体消除其作用后，IL—l 仍然具有抗肿瘤作用，但其确切作用机制尚未明了。为此，本课题研究外 源性IL．18基因在体外对C6胶质瘤细胞生物学特性和化疗敏感性的影响。 本研究分四部分。 第一部分：外源性lL一18基因对大鼠c6胶质瘤细胞生长特性的影响 目的：研究外源性IL—18基因对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭力、克隆 形成率等生长特性的影响及其可能分子机制。 方法： 1细胞培养 基培养，内含10％胎牛血清、青霉素100 u／ml、链霉素100u∥ml。置饱 和湿度、37℃、5％c02培养箱培养。 中文摘要 2MTT法检测细胞体外增殖活性 以1．5×104／ml细胞浓度接种于96孔培养板，每孔加入200ul细胞悬液， 37℃，5％C02培养箱培养6天。每日检测细胞生长情况。每孔加入5m2／ml MTT 20pl，继续孵育4小时，离心吸去上清，加入150ul／孔DMsO。用 制细胞生长曲线。本实验重复3次。 3体外肿瘤侵袭实验 ／m1)800“l，用含MatrigelMatrix的聚碳酸酯膜将上、下室隔开，将Boyden 小室放入湿盒中，C025％培养箱培养24h。取出聚碳酸酯膜，擦去膜上面 未侵入膜中的细胞，将膜放在载玻片上，甲醇固定，苏木精染色，乙醇逐 级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在高倍光镜计数穿过每张膜的细胞 数。 4集落形成试验 24孔培养板，每孔设4个复孔，37℃5％C02培养箱培养12天。培养结束时， 下观察，计算集落形成率(集落形成率=集落数／接种细胞数×100％)。 5免疫细胞化学与计算机图像分析 对数生长期c6／1L一18、c6／pLxsN和C6细胞，接种于预先置有无菌 min， 盖片的6孔培养板中，待细胞爬满盖片后，用4％多聚甲醛固定10 min。0．3％Tritonx—loo处理10 3％过氧化氢处理lO min、10％正常羊血 清处理15 作为阴性对照。羊抗鼠生物素标记的二抗37℃温育40m‰过氧化物酶 精脱水、二甲苯透明、封片。在光镜下随机观察8个视野，共计数300 个细胞，并计算阳性细胞标记指数。 将细胞爬片置于显微镜下，摄像系统提取数值化细胞图像并输入计 算机，在计算机屏幕上用鼠标选定免疫组化阳性部分，每种细胞随机选取 中文摘要 8个视野进行定量分析，测定PcNA免疫细胞化学反应阳性颗粒的平均光 密度值(0D)。 6R1二PcR检测PCNAmRNA的表达 根据核苷酸序列用Premjer 总。RNA逆转录成cDNA(37℃60 行PCR扩增。条件为95℃预变性10