贴壁细胞培养实验讲义.docVIP

贴壁细胞培养技术课讲义 一、克隆形成及克隆形成抑制试验 克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。 常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。 平板克隆形成实验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 1.准备所需试剂及物品： ①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组） ②PBS ③0.25%胰酶 ④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-F）注射液江苏南通精华制药有限公司，0 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），x 8）使用前稀释至所需浓度。取对数生，用含血清度×102cell/mL，接种于孔板1000 μL/孔血清血清血清血清5％CO2，饱和湿度条件箱内孵育加入37℃，5％CO2，饱和湿度条件箱内孵育μg/ml 组别 5 – FU药物（100ug/ml）ul 培养液 ul 1 对照 0 100 2 10 90 3 20 80 4 30 70 5 40 60 6 50 50 具体配制： 准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。每组为两个复孔，多计算一孔，每组试剂用量均*3（以免加量不准，多备）。 2组：5-Fu 30 ul + 培养液 270 ul（10ul*3孔=30ul 90ul*3孔=270ul） 3组：5-Fu 60 ul + 培养液 240 ul 4组：5-Fu 90 ul + 培养液 210 ul 5组：5-Fu 120 ul + 培养液 180 ul 6组：5-Fu 150 ul + 培养液 150 ul 混匀后每孔按分组加入100ul配制溶液。 震荡混匀（加药后不要摇动） 放入CO2孵箱中继续培养4-5天（根据对照空细胞生长情况而定） 第五或第六天 ⑷ 细胞固定（或省去该步骤） 吸去培养液，加入PBS洗涤后，用甲醇:冰醋酸固定染色–实验组细胞克隆数) 对照组细胞克隆数 ×100％。 二、MTT比色法 MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。商品名噻唑蓝，MTT。 活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。而死细胞无此功能。 二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 与其他检测方法如细胞计数法， H3掺入法，LDH法有良好的相关性。 1.准备所需试剂及物品： ① MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M， pH7.4）在电磁力搅拌仪上搅拌30min。用0.22 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。 10 %新生牛血清的RPMI-1640， 0.25%胰酶，DMSO（分析纯） ③ 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-F）注射液江苏南通精华制药有限公司，用无菌生理盐水配制成10 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。 具体操作： 2块96孔板，MTT与WST两方法同时做。 一块用MTT检测，一块用WST检测（方法基本同MTT法，见后） 第一天 接种细胞，取上克隆形成实验④中计数好之细胞4 X 104cell/ml， 每孔10 μL，接种到96孔板37℃，5％CO2，饱和湿度条件箱内孵育– FU 约0—— 25 μg/ml 组别 5 – FU（100ug/ml） ul 培养液 ul 1 对照 0 40 2 4 36 3 6 34 4 12 28 5 24 16 6 36 4 具体配制： 准备五支1.5ml Ep（对照孔直接加培养基），分别配制好上表中各组不同5-Fu浓度试剂后，再加入培养板孔中。每组为三