重组pET28α-X基因构建与表达实验.docxVIP

重组pET28α-X基因构建与表达DNA的连接1、原理 本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接成表达融合蛋白的重组质粒。（1）灭菌双蒸水（2）DNA：双酶切后的基因片段及线性质粒（3）T4DNA连接酶：350U/μL（4）10连接酶缓冲液：660mmol/L Tris-HCl(pH7.6)66 mmol/L MgCl2100 mmol/L DTTmmol/L ATP2、方法（1）5mL离心管中加入以下成分： ddH2O 12μL X-DNA 3μL pET28a-DNA 2μL 10Buffer 2μL T4 ligase 1μL（2）14-16℃水浴中过夜。（3）65℃水浴10min，灭活连接酶。二、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、原理 经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因，应根据转化菌的耐药特性进行筛选。2、材料 （1）LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至950mL，用1mol/L NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌。（2）LK培养基：在LB培养基中加入终浓度50μg/mL的卡那霉素。（3）LK平皿：1.5g琼脂，100mL LB培养基，高压灭菌，待其降温至55℃时，加卡那霉素至50μg/mL，倾倒平皿，置室温一天，使水分吸收，4℃保存。（4）100mmol/L CaCl2,用双蒸水配制，高压灭菌，4℃保存。3、小量制备大肠杆菌感受态细胞（1）接种大肠杆菌DH5α和BL21单菌落于2mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。（2）转种1 mL过夜培养菌液于20mL LB培养基中。（3）37℃培养至细菌密度OD600为0.4（约2.5h）。（4）取1 mL菌液至1.5 mL离心管，4000rpm，2min,弃上清液。（5）加500μL 100mmol/L CaCl2,混匀，冰浴30 min。（6）离心（4℃，4000rpm，2min），弃上清液。（7）加100μL 100mmol/L CaCl2,重新悬浮沉淀，此即制备好的感受态细胞。4、转化 （1）另取1.5 mL离心管，加连接反应液20μL，再加50μL感受态细胞，混匀，冰浴30 min。（2）42℃水浴90s，再冰浴1-2 min.（3）加500μL LB，37℃温育1h。（4）取DH5α和BL21感受态细胞各25μL涂布于LB平皿，DH5α和BL21感受态细胞各25μL涂布于LK平皿，DH5α和BL21转化菌液各50-100μL涂布于LK平皿，37℃培养过夜。（5）检查细菌生长情况，可看到LB平皿上两种感受态细胞密集生长，两种感受态细胞在LK平皿上不生长，只有转化菌才能在LK平皿中生长。三、碱裂解法小量制备质粒DNA1、基本原理 碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的。在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构;通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中; 离心后上清中便含有所需要的质粒DNA, 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。2、材料 （1）转化后的细菌（2）含卡那霉素（终浓度50μg/mL）的LB培养基。（3）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA(pH8.0)高压灭菌15min，4℃保存。（4）溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 1.0% SDS临用前配制。（5）溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸钾 60 mL冰醋酸 11.5 mLH2O 28.5 mL该溶液中[K+]是3 m