高效液相色谱法综述.docVIP

高效液相色谱法 前言： 高效液相色谱法适用的范围很广，是非常重要的分析方法之一，它在医药学及生命科学中成为一种主要的分离检测手段。与分离方法的迅速发展的同时，检测技术的不断进步也是高效液相色谱技术得到广泛应用的原因之一。近年来高效液相色谱检测技术从最常用的紫外可见分光光度检测器和差示折光检测器开始，已经发展了诸如能够实时定性和定量的二极管阵列紫外可见分光光度检测器，能够快速扫描和光谱分辨率更高的色散型紫外可见分光光度检测器以及适用于生物化学的电化学检测器等。各种联用检测手段如与质谱联用的热喷雾和粒子束接口等已日趋成熟，与傅里叶变换红外光谱和拉曼光谱的联用技术亦在发展中。各种检测器的灵敏度、线性范围、稳定性和重现性等主要指标日益提高。许多新的检测手段已为科技工作者所熟悉和使用。目前比较引人注目和发展较快的为手性化合物的直接检测和通用型质量检测技术。 分离原理 在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配，这种分配过程即为色谱过程。由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱分析法的实质。也就是说，当一种不与被分析物质发生化学反应的被称为载气的永久性气体（例如H2 、N2 、He、 Ar 、CO2 等）携带样品中各组分通过装有固定相的色谱柱时，由于试样分子与固定相分子间发生吸附、溶解、结合或离子交换，使试样分子随载气在两相之间反复多次分配，使那些分配系数只有微小差别的组分发生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离，例如一个试样中含A、B二个组分，已知B组分在固定相中的分配系数大于A，即KB KA ，如图1-1所示。 当样品进入色谱柱时，组分A、B以一条混合谱带出现，由于组分B在固定相中的溶解能力比A大，因此组分A的移动速度大于B，经过多次反复分配后，分配系数较小的组分A首先被带出色谱柱，而分配系数较大的组分B则迟被带出色谱柱，于是样品中各组分达到分离的目的。设法将流出色谱柱某组分的浓度变化用电压、电流信号记录下来，便可逐一进行定性和定量分析。一, 高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备,若用于分析则采用脱机或非连续检测经典LC填料缺陷,通常是填料粒度大范围宽不规则不易填充均匀扩散和传质阻力大,谱带展宽加大它存在致命弱点:速度慢效率低和灵敏度低HPLC填料(高效固定相)颗粒细,直径范围窄,能承受高压达到传质阻力小,分离效率高早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备,液膜厚度df大,这和GC一样,会大大降低色谱柱的柱效现代HPLC填料大多采用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效高效固定相会带来什么新问题呢使用高效填料带来两个新问题:一是柱流动阻力大大增大,因此需要采用高压泵输液二是表面能很大,要采用专业的装柱技术高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同,但是它采用了高效色谱柱,高压输液泵和高灵敏度检测器因此高效液相色谱的分离效率,分析速度和灵敏度大大提高定量准确,达到可与GC相媲美的分离分析性能特别是结合计算机技术,HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器经典的液相色谱法,流动相在常压下输送,所用的固定相柱效低,分析周期长,例如柱长170㎝,柱内径0.9㎝,流动相速度30㎝3/h,约需20多小时才能分离出20种氨氨基酸而用高效液相色谱法,只需1小时之内就完成而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论,流动相改为高压输送,色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料(几微米至几十微米)填充而成,均匀规则的固定相传质阻力小分离效率高柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或100几十万)同时柱后连有高灵敏度的检测器,使分析灵敏度比经典色谱有较大提高例如用紫外检测器最小检测限可达到10-9g而荧光检测器则可达到10-11g虽然气相色谱法是一种很好的分离分析方法它具有分析速度快,分离效能好和灵敏度高等优点但是气相色谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质据估计,在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15%,加上制成衍生物的化合物,也不过20%左右由于大量有机物,离子型化合物易受热分解或失活物质不能用GC分析,因此需要发展HPLC对于高沸点化合物难挥发及热不稳定的化合物,离子型化合物及高聚物等,很难用气相色谱法分析为解决这个问题,70年代初发展了高效液相色谱二高效液相色谱法与气相色谱法比较HPLC的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数分配比塔板高度分离度选择性等方面均与气相色谱相一致高效液相色谱