饲料中植酸酶活性的测定.docVIP

饲料中植酸酶活性测定方法探讨 摘 要:参照国标测定植酸酶活性的方法,研究了钼黄法和钼蓝法的稳定性及植酸酶活性测定时反应体系中缓冲液、pH值以及Cu、Zn、Mn金属离子对酶活性的影响。结果表明:钼黄法与改进后的钼蓝法稳定性没有明显差异,但钼蓝法更适合微量磷的测定;柠檬酸盐缓冲液作为植酸酶酶解反应的缓冲体系时显色的稳定性较差;反应温度、pH及Cu、Zn金属离子对酶活性影响较大,测定植酸酶活性时需要严格控制反应条件,屏蔽金属离子的干扰。 关键词:饲料;植酸酶;活性;测定 目前,植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用, 但饲料中植酸酶活性的测定方法还存在一些争议。2002年, 国家颁布了饲用植酸酶活性的测定方法标准(GB/T 18634) 2002),该标准注明其适用于饲料添加剂用的植酸酶产品,也 适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合 饲料,但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然 更为复杂,其适用性受到质疑[1]。因此,关于饲料中植酸酶 活性测定方法问题有待进一步研究。 1 试验材料与方法 1.1 主要仪器与设备 电热恒温水浴锅(室温-100e,控温精度?1e)、离心 机(最高转速6 000 r/min)、721型分光光度计、分析天平、pH 计、磁力搅拌器、0. 22Lm微孔滤膜。 1.2 试剂 1.2.1 偏钒酸铵-钼酸铵-硝酸显色液 方法见GB/T 18634)2002。 1.2.2 盐酸-乙酸钠缓冲液 方法见GB/T 18634)2002乙酸缓冲液(I)的配制。 1.2.3 磷标准溶液 将磷酸二氢钾于105e恒温箱中干燥2 h,在干燥器中 保存;称取磷酸二氢钾0. 020 3 g,溶解于蒸馏水中定容至 100 ml。 1.2.4 植酸酶溶液 方法见GB/T 18634)2002。 1.2.5 植酸钠溶液 方法见GB/T 18634)2002。 1.2.6 硫酸-钼酸铵溶液 量取20 ml浓硫酸(98% )于100 ml蒸馏水中,称取 1. 500 g钼酸铵微热溶解于50 ml蒸馏水中,按比例混合待 用。 1.2.7 抗坏血酸溶液 称取5. 400 g抗坏血酸用蒸馏水溶解,定容至100 m,l于 4e冰箱保存待用。 1.2.8 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 按一定体积比混合0. 1 mol/L柠檬酸溶液和0. 1 mol/L 柠檬酸钠溶液,用pH计调节,使其pH值分别至2. 50、3. 50、 4. 50、5. 50、6. 50、7. 50。 1.2.9 SnCl2-甘油溶液 称取2. 501 g SnCl2溶解于100 ml甘油中,避光保存,溶 液可稳定数周。 1.2.10 钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液 量取硫酸-钼酸铵溶液150 m,l称取0. 070 g酒石酸氧 锑钾溶于20 ml蒸馏水,将以上溶液混合待用。 1.2.11 三氯乙酸溶液 量取三氯乙酸15 ml用蒸馏水定容至100 ml。 1.2.12 硫酸锌溶液 称取0. 088 5 g ZnSO4#7H2O于100 ml容量瓶中,用 pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。 1.2.13 硫酸铜溶液 称取0. 078 2 g CuSO4#5H2O于100 ml容量瓶中,用 pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。 1.2.14 硫酸锰溶液 称取0. 061 5 g MnSO4#H2O于100 ml容量瓶中,用 pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。 1.3 试验方法 1.3.1 植酸酶活性单位的定义 国家标准GB/T 18634)2002定义:植酸酶样品在植酸 钠浓度为5. 0 mmol/L、温度37e、pH值5. 50的条件下,每 1 min从植酸钠中释放1Lmol无机磷,即为一个植酸酶活性 单位,以/U0表示。 1.3.2 测定原理 钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值 条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性 环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415 nm波长下 进行比色分析。 钼蓝法原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底 物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钼酸42 万 丹等:饲料中植酸酶活性测定方法探讨/2007年第11期 铵处理生成蓝色复合物,在810 nm波长下进行比色分析。 1.3.3 钼蓝法反应条件的探讨 1.3.3.1 SnCl2-甘油溶液和抗坏血酸-酒石酸氧锑钾作反 应体系还原剂的比较 分别取磷标准溶液2 ml放至4个50 ml容量瓶中,分A、 B组,每组2个平行样。A组分别加入4 ml钼酸铵-硫酸- 酒石酸氧锑钾显色液, 1 ml抗坏血酸溶液,定容至50 m;l B 组分别加入4滴SnCl2-甘油溶液, 2 ml