酵母醇脱氢酶提取和专一性测定.pptVIP

酵母醇脱氢酶的提取及 专一性测定;一、实验目的 掌握醇脱氢酶的提纯的原理和方法。;二、实验原理 以酵母为原理，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白等方法，提取具有一定纯度的醇脱氢酶，注意每一步提纯均需测定蛋白含量及酶活力。 醇脱氢酶的辅酶NAD （过量）CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO+NADH+H+ 当醇过量时，NAD+被还原速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多，后者对340nm有较强吸收；通过测定NADH含量，得知酶活力大小。 ;三、实验器材 37℃，55℃水浴 紫外-可见光分光光度计 ，石英比色皿 冰浴 离心机 ，离心管 透析袋（截留分子量5000-10000Da） ;四、实验试剂 1. 酵母 2. 3M 乙醇 3. 0.06M 焦磷酸钠（pH 8.5） 4.0.0015M NAD 5.0.01M K2HPO4 6. 丙酮 （预冷） 7. 0.066M Na2HPO4 ;五、实验步骤 （一）提纯酵母醇脱氢酶 1. 粗提 取20g干酵母于250ml烧杯中，加80ml 0.066M Na2HPO4，37℃保温2小时，不断搅拌，室温再提取3小时，4000rpm，离心20min，量取上清液V1，留2ml上清测蛋白含量及酶活力。 2. 热变性去杂蛋白 将剩余上清55℃加热15-20min，不断搅拌，冷水冷却后，4000rpm，离心20min，得上清液V2，，留2ml上清测蛋白含量及酶活力。 3. 有机溶剂沉淀杂蛋白 将上清置于盐冰浴中，加入50%上清体积的预冷丙酮，边加边搅拌，放片刻，0℃，4000rpm，离心5-10min，留2ml上清测蛋白含量及酶活力，其余上清置于盐冰浴中。 4. 有机溶剂沉淀酶蛋白 将其余上清中逐滴加入11/22上清体积的预冷丙酮，待沉淀完全后，0℃，4000rpm，离心15min。弃上清，将沉淀溶于少许蒸馏水中，转移至透析袋中，对冷水透析3h（冰箱中），离心去沉淀，上清即达到一定纯度的醇脱氢酶制剂。;五、实验步骤 （二）蛋白浓度测定 （Folin-酚法或紫外吸收法测定） 将前面四步所留取得上清，分别用少许蒸馏水稀释100-200倍后，测浓度。 （三）酶活力测定 1. 将前面四步所留取得上清用0.01M K2HPO4稀释如下： 第一步上清稀释5倍； 第二、三、四步各稀释10倍。 2. 准备试管5只，编号1-5，加入以下四种试剂：  3. 再向试管1中加入1ml蒸馏水；试管2-5中分别加入1ml K2HPO4稀释后的上清，混匀后，以第一支试管为空白，立即测A340nm。每隔15s测一次，直到A340nm不变。（注意，2-5号管可按照一支一支的测）。以每分钟A340nm增加0.001为1个活力单位。;五、实验步骤 （四）结果 （按照测定的数据完成下表） C= A×B E=A×D F= D/B