分生实验4：质粒提取与电泳.pptVIP

目的 DNA片段 ;上次实验小结;小量制备质粒和电泳分析 ;质粒……;1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。 ;质粒DNA与基因组DNA的区别;碱裂解法提取质粒的原理;1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体 0.2mol/L NaOH 1% SDS ;3）中和液（溶液III） ----中和NaOH 60 ml 5mol/L 醋酸钾 11.5ml 冰醋酸 28.5ml 水 4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 ? g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。;;（去除蛋白质） （4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。 （5）将上层水??移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min， 12,000转/分 离心 5min 。 （沉淀DNA） （6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。 ;下午实验内容;（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。 （去除RNA） （8）用20?l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min; 取10 ? l 的质粒DNA 加2 ? l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100V 40min。 电泳结束后照像保存，结果分析。;质粒提取方法;方法举例：;特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）;质粒的电泳;重组质粒的鉴定;质粒电泳