试验中常用试剂的配制和注意事项.doc

RT-PCR实验操作步骤这与你要PCR的模板DNA有关，不同的模板有不同的最适退火温度。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 一.所用试剂 ?1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 ?2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。 ?3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。40C保存。 ?4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 ?5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 ?6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 ?7.0.1%DEPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1%DEPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。 ?8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。 ?9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。 ?10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x电泳缓冲液500ml。 ?11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。 ?12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。 ?13.1.5％琼脂糖：RNA电泳，1.5g琼脂糖加入0.5xTBE RNA电泳缓冲液中;DNA电泳, 1.5g琼脂糖加入1xTAE DNA电泳缓冲液中。微波炉煮沸熔化后，冷却至600C左右，每100ml胶加入溴化乙啶(EB,10mg/ml)5ul。 ?14.溴化乙锭（10mg/ml）：在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。 ?15.人淋巴细胞分离液：上海华精生化试剂厂。 二.总RNA提取 [注]1.本方法采用Chomczynski一步法，用单相细胞裂解试剂TRizoL破碎细胞和灭活细胞中内源性RNA酶同步进行，可同时分离RNA、DNA和蛋白质。TRizoL中含有酚、强变性剂硫氰酸狐和溶解剂等。本法所提取的RNA可用于RT-PCR、Northern印迹杂交等。 ??? 2.最好单独存放用于RNA实验的试剂，以防止污染。 ??? 3.耐高温的匀浆器、研钵及研棒用锡箔纸包好，2000C干烤5小时，灭活外源性RNA酶。 ??? 4.离心管、枪头等塑料制品用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡12小时以上灭活外源性RNA酶。再用去离子水浸泡10分钟x3次，以去除DEPC，然后70-800C烤干，高压蒸汽灭菌30分钟除去残留的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。 ??? 5.提取RNA所用的去离子水及配制试剂均要经含0.1%DEPC处理。??? ??? 6.如果是从完整包装中新取出的塑料制品，一般无外源性RNA酶污染，可以直接使用。 ??? 7.实验者的双手是外源性RNA酶的重要污染源，因此务必戴手套进行操作。 ??? 8.DEPC为可疑致癌物，且有芳香性挥发气味，使用时应戴手套、口罩，并打开排气扇。 ??? 9.RNA紫外分光光度计定量所用石英比色皿使用后，在1：1盐酸甲醇中浸泡30分钟以上，再用0.1%DEPC处理去离子水冲洗干净，凉干。 ??? 10.用于RNA电泳的电泳槽用去污剂清洗干净，自来水冲洗数次，再用去离子水冲洗1次，无水乙醇擦洗，干燥。然后灌满3％的双氧水室温放置10分钟，最后用DEPC处理的去离子水冲洗3次。 ??? 11.提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳后，28S rRNA和18S rRNA应当能清楚地在紫外分析仪下看到，也应当能看到一条由tRNA, 5.8S rRNA和5S rRNA组成的，较模糊迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28S rRNA的亮度应当是18S rRNA亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。加样孔附近有条带表