茶树抗寒转录组分析方案.doc

茶树抗寒转录组分析 1. 项目背景及目的： 背景：随着近期茶树基因组的发表[1]，对茶树的各方面研究将会更加便利。该研究拟从转录组层面，对两种具有明显抗寒差异的茶树品种进行研究。希望从转录组层面，阐述两不同茶树品种产生耐寒性差异的机理。 采样方案：选取生长时间相同（最好为1-3年生材料，如果在幼苗期寒冷胁迫下也不会死亡，也可以考虑使用幼苗），耐寒性差异较大的两个茶树品种（A：敏感型， B：耐寒型）。在低温处理前，先将材料移栽回温室，控制室温为25°C ，采取每天 16h 光照周期 (110–150 μmol_m-2_s-1)培育7天。低温处理分为两种，4°C 处理为chilling treatment （CT）, -5°C 处理为freezing treatment（FT），将植物同一时间进行处理，4h 和8h后分别取样（同一时间也取在常温下为做处理的样本作为对照组CK (CK包含0h 取样)）。取完全展开的第三片叶片（可以取其它位置，但需保证所有材料叶片取得位置一致），每组设三个生物学重复，叶片取好后用锡箔纸包好放入液氮中，在放到-80°C冰箱保存，直至提取样品RNA [2]. 总数据量：2品种*3处理（ck,ct,ft） PS：1. 如果预算有限，两种处理（CT or FT）可只选其中一种 2. 处理时间点，可根据寒冷胁迫基因qPCR结果，选取表达差异最大的两个时间点，4h,8h仅供参考。（qPCR 时间点可设为2h,4h,6h,8h,10h,24h,48h, marker gene可选下图中的3-4个,参考文献[2]） 图1：寒冷处理后基因的表达变化（5个组别分别代表ck,CT4h,CT8h,FT4h,FT8h） 2. 分析期望： 找出与耐寒相关的基因极其通路。 找出与耐寒相关的可变剪切。 3. 标准分析 mRNA部分： 1. 数据过滤质控及统计 （fastqc） 2. 与参考序列比对及统计、评估；(Tophat) 3. 基因和转录本表达定量分析； (cuffinks+RSEM) 4. 基因差异表达分析； (RSEM/Ebseq,edgeR) 5. 差异基因的功能富集分析；(GO/KEGG) 6. 差异基因层次聚类分析； （通过基因表达量，Eucledian distance matrix，热图） 7. 差异基因蛋白互作网络分析；（STRING database） 8. 可变剪接分析 (rMATS) 9. 差异可变剪切分析 （Juncbase） 10. 新转录本预测； (Trinity) 4. 个性化分析： 差异表达分析 （A1VS B1 A2VS B2）分别对两物种的2个时间点进行差异分析，筛选出差异表达的基因作为候选分析集合。 图2:差异表达基因热图 （A1vsA0, A1VS A2 , B1vsB0, B1VS B2）分别对两物种前后时间点进行差异分析，观察两品种茶树在快速胁迫响应上是否有巨大差异，筛选出候选基因。 综合通路富集和功能富集，筛选出与胚胎发育相关的基因。 图2: GO analysis 图3: KEGG通路分析示意图 将差异表达基因与转录因子（transcription factors:TF）数据库进行比对，观察有多少TF存在差异表达，在对比其趋势是否与整体差异基因的上调和下调有很强的关联。 差异可变剪切分析 寒冷胁迫后，可变剪切总数的变化。 差异可变剪切分析，分组与差异基因相同。 差异可变剪切基因GO/KEGG分析。 差异可变剪切基因与差异表达基因的交集情况。 5. 项目周期 标准分析+个性化分析：30个工作日 文章撰写（初稿投出+图表优化）：40个工作日 6. 项目报价 测序+标准化分析：1600*30 = 48000（2个处理）1600*42 = 67200（3个处理） 个性化分析（按2个处理报价）：12000 文章撰写（初稿投出+图表优化）：50000（保底IF3） References: [1] Xia E H, Zhang H B, Sheng J, et al. The Tea Tree Genome Provides Insights into Tea Flavor and Independent Evolution of Caffeine Biosynthesis.[J]. Molecular Plant, 2017. [2] Zheng C, Zhao L, Wang Y, et al. Integrated RNA-Seq and sRNA-Seq Analysis Identifies Chilling and Freezing Responsive Key Molecular Players and Pathways in Tea Plant (Came