Westernbloting经验总结1试剂准备详细参考试剂配方2制胶21.DOC

Western bloting经验总结 1.试剂准备 详细参考试剂配方 2.制胶 2.1 准备好制胶器，玻璃板务必要干净，否则容易产生气泡或使胶不平；玻璃板需卡紧，先用1ml H2O试探，以防漏胶。将水倒去后用滤纸把残留在玻璃板上的水吸去（轻轻的，不要使卡紧的玻璃板松动）。 2.2 配胶：按需要配制适当浓度的胶，如上表及SDS分离胶配方表。充分混匀，尽量不要弄出气泡（可以轻轻快速旋转配胶用的烧杯30 s到1min，切莫太快以免液体溅出，如图所示[不是自转]；若用枪反复吹打，不要太快以免产生大量气泡） 2.3 将胶慢慢加入到玻璃空隙中。枪头可残留部分液体，以免把气泡打进玻璃板间，胶约7 ml（1.5mm厚，六一24D型）。 2.4 压胶：用无水乙醇或水轻轻地沿板加入，每块胶上加600 ul-1000 ul。放于室温或37℃，务必放平，不平则胶歪，导致显出的蛋白条带歪曲。 2.4 20 min后倒去无水乙醇或水，用滤纸吸干。（若胶不凝，可放30 min，再不凝的话就要考虑，10%AP溶液是否过期（有效一周）或浓度是否配错，是否忘记加促凝剂TEMED）。 2.5 配制浓缩胶(5%)并混匀，插好梳子，轻轻从梳子两端缝隙加入浓缩胶，直到胶快溢出梳子（溢出也无妨），检查是否有气泡，若有，将梳子轻轻拔出，重新插好。放于室温或37℃，30分钟（浓缩胶较稀，时间要长些） 3.冲洗加样孔：小心拔出梳子，若加样孔扭曲变形，可用针头将其扶正（勿将针头插到胶中）,先加部分1×SDS电泳缓冲液到内槽,用枪头吸电泳液轻轻冲洗加样孔，以排除气泡。 4.排除槽底的气泡：将内置电泳槽放在外槽中，加入1×SDS电泳缓冲液（外槽液，可以是内槽回收液）溢过底部胶（液面离底部3-4cm即可），倾斜整个电泳槽，反复提起放下内电泳槽，直至完全排除内槽底的气泡。 5.上样：蛋白样本与一定比例的上样buffer（5×）4:1混匀，沸煮3-5分钟。按的等质量上样，一般30-100ug，磷酸化200ug总蛋白。另外留一孔加蛋白maker(预染)。 6.电泳： 6.1把电泳槽放在底部较平的脸盆里（一些底部不平，中央突起或凹下，可放在偏侧，若不平，电泳后整个条带会倾斜）； 6.2在脸盆上加一些冰（电泳会产热，热这电阻增大，功率降低；温度增高也会促进磷酸化蛋白降解）； 6.3将内槽加满电泳液，至少要把内玻璃板溢过，使电泳液接触到SDS胶，这样才能通电（内槽为负极，外槽为正极）。 6.4设置电流电压，一般两步法： (1) 80 V,30 min ,电流不恒定，可设置额定电流50mA. (2)100-120V ,分子量小的话就用120V，分子量大的蛋白可用100V,时间为1 h-2 h，分子量越大时间越长。电流可设为100mA.若两个电泳槽一起跑电泳，电压不变，电流增加一倍（并联）。 6.5电泳至MAKER分开，染料跑到胶的最底部边缘即可停止。 7.转膜： 7.1倒去外槽液，回收内槽液。 7.2切胶，按所需分子量大小，在相应的位置切下宽为1cm /1.2cm或更宽，长度按上样孔多少计算。将胶放在负极转膜液中浸泡20 min（分子量越大泡的时间越长可以~40min，不宜过分浸泡，因胶泡时间长后会变长变宽）。 7.3同时剪切相应大小的厚滤纸（不宜比胶过大，以免短路），浸泡在负极转膜液≥20分钟。 7.4 PVDF膜：大小与胶相同; 平衡PVDF膜：甲醇，30 s → ddH2O，2 min → 正极液≥15 min。（甲醇激活PVDF膜正极基团，从而使蛋白容易结合），同时剪切相应大小的厚滤纸，放在正极液中浸泡。 7.5转膜（半干转） (1) 三明治结构： 底下（正极）正极滤纸—PVDF膜—胶—负极滤（负极盖子）。 注意：层层之间不能有气泡（用镊子或玻璃棒赶出气泡），特别是膜与胶之间不能用气泡。 (2) 转膜条件:（恒流） 一般用0.1mA每张膜（1cm×5～8cm））”发热（通电产热），电压可能会不断升高，甚至超过25V，滤纸应多加转膜液，不要挤去，尽量使用旧的滤纸（吸收的液体较多）。 转膜条件可适当调整（丽春红染膜，可判定转膜是否成功）。 8.封闭： 8.1转膜完成后，将膜置于TBS/TBST中清洗1-2min（可用摇床）以洗去转膜液。 8.2置于5%脱脂奶粉溶液（1g奶粉+20 mlTBST）中封闭,盖上保鲜膜，室温3-6 h/4℃ 过夜（12 h），若用摇床则更佳。磷酸化蛋白宜在4℃。 注意：膜不能重叠于一起，如果膜多且长，最好分开封闭（多个器皿）。 9．一抗： 9.1根据抗体说明书稀释抗体，可以用5%封闭用蛋白奶粉溶液或5% BSA溶液作稀释液，一般中杉金桥的β-actin一抗1：500,CST公司1:1000-2000； 9.2将膜放在平的蜡板上，用滤纸吸干多余液体（从膜边上