第4章-基因操作中大分子的分离和分析.pptVIP

第四章 基因操作中大分子的分离和分析 第一节 DNA的分离、检测和纯化 第四章 基因操作中大分子的分离和分析 一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA 2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA 1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA 原理： 碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异： 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态； 将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。 通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋 质粒提取 （一）仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料： 含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌 （三）试剂： LB培养基（液体、固体） 溶液I　 溶液II　 溶液III　 TE(pH8.0) 2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA 二、电泳检测 （一） DNA的琼脂糖凝胶电泳 （二）聚丙烯酰胺电泳 （三）脉冲场凝胶电泳 （一）DNA的琼脂