肌肌酸激酶MB同功酶克隆和原核表达.docVIP

人心肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表达 李子颖作者单位： 原子高科股份有限公司（北京 102413）；2中国食品药品检定研究院（北京 100050）；3 中国原子能科学研究院通讯作者： 李子颖，E-mail：ciaelee@，贾娟娟2，刘一兵1 作者单位： 原子高科股份有限公司（北京 102413）；2中国食品药品检定研究院（北京 100050）；3 中国原子能科学研究院 通讯作者： 李子颖，E-mail：ciaelee@ 【摘要】 目的 构建人肌酸激酶MB同工酶的原核表达系统，纯化重组酶蛋白并检测其活性。方法 从购买的含CKM、CKB基因片段的质粒中扩增人肌酸激酶M、B亚基基因，构建pGEX-4T-1-CKMB E．coli BL21 (DE3)GST原核表达系统。以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。利用重组蛋白的GST标签亲和层析纯化。结果 重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期相符，诱导表达后细菌裂解液纯化后SDS—PAGE在分子量110,000（CKMB）处显示单一蛋白条带，采用酶联免疫分析的方法进行免疫活性实验，所得的蛋白和CKB、CKM抗体都有免疫结合。结论 成功表达并纯化了人肌酸激酶MB同工酶。 【关键词】：人肌酸激酶MB同工酶；原核细胞；基因表达 Cloning and prokaryotic expression of humn creatine kinase-MB isoenzyme(CK-MB) Li Zi-ying*, Jia Juan-juan, Liu Yi-bing, Han Shi-quan（*Atom HighTech Co., Ltd.， Beijing，102413 ，China） 【Abstract】 Objective To clone the whole gene of human creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB) and express in prokaryotic cells, then purify recombinant CK-MB and determine its antigen-binding activity. Methods The CKM、CKB gene were amplified from plasmid we bought and insert into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with GST tag. The construct recombinant plasmid pGEX-4T-1-CKMB was transformed to E coli. BL21(DE3) for expression under induction of IPTG. The expressed fusion protein was purified by GST chromatography, then determined antigen-binding activity by ELISA. Results PCR、restriction analysis and sequencing proved that recombinant pGEX-4T-1-CKMB was constructed correctly. The expressed recombinant fusion protein with relative molecular mass 110 000 showed specific binding to policolonal antibody against CKM and CKB. Conclution The CK-MB was successfully expressed in prokaryotic cells and purified. [Key words] Humn creatine kinase-MB isoenzyme；Prokaryotic cells；Gene expression 急性心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)患者存活率的关键是早期快速诊断，因为心肌细胞在梗死6 h后通常不可逆转。对于诊断急性心肌梗死(AMI)，目前心肌标志物中的肌酸激酶(creatine kinase MB， CK-MB)质量被视为诊断急性心肌梗死较敏感的指标之一[1]。 肌酸激酶同工酶CK-MB主要存在于心肌细胞中。急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞受损，膜的完整性和通透性改变，使细胞内的大分子逸出，能在外周血中被检测到。这些大分子物质被称为心肌损伤标志物。在这些心肌标志物中CK-M