基因工程制药下游技术.pptVIP

第八节 基因工程制药的下游技术 ;获得目的基因;一、 重组工程菌的培养;（一）、基因工程菌的培养方式;分批培养;连续培养;透析培养;固定化培养;（二）、基因工程菌的培养工艺;2.1 培养基的影响;;2.2 接种量的影响;温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子合成等水平上 温度影响蛋白质的活性和包含体的形成;溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。菌群在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给很重要 采用调整搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量（发酵前期采用较低转速，培养后期采用高搅拌转速）;在发酵过程中pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件决定 采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的最佳生长条件（最佳pH范围为6.8-7.4 ），培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达条件（最佳pH为6.0-6.5） ;诱导时机的影响：一般在对数生长期或对数生长后期诱导表达 诱导表达程序的影响;二、 基因工程药物的分离纯化 ;基因工程药物的特点;（一）、建立工艺需了解各种因素;（二）、分离纯化的基本过程;（三）、细胞的破碎方法;（四）、固液分离;（五）、重组蛋白质的分离纯化;离子交换层析;;疏水层析;;亲和层析;;凝胶过滤层析;;;（六）、非蛋白质类杂质的去除;根据产物表达形式来选择 根据分离单元之间的衔接选择 根据分离纯化工艺的要求来选择;7.1 根据产物表达形式来选择;;选择不同机制的分离单元组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效分离手段，将含量最多的杂质先分离去除，将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段;;色谱分离次序的选择;要具有良好的稳定性和重复性 要尽可能减少组成工艺的步骤 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整;;三、 基因工程药物的质量控制;;;（一）、医药生物技术产品质量保证要点;（二）、生物材料的质量控制;（三）、培养过程的质量控制;（四）、纯化过程的质量控制;（五）、目标产品的质量控制;生物活性测定;理化性质鉴定;;氨基酸组成分析 部分氨基酸序列分析：测定N端15个氨基酸，C端应根据情况测定1-3个氨基酸 蛋白质二硫键分析;蛋白质含量测定和纯度分析;杂质检测;稳定性考察和产品一致性;（六）、产品的保存;液态保存;固态保存;;四、 基因工程药物制造实例; 干扰素是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别仅表现为个别氨基酸。 是我国已经批准上市的基因工程药物。 早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg 。; 2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。;（一）、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC ; 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌k12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄 用已知干扰素的DNA片断作为 青霉素敏感细菌克隆 探针挑选富有干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达;（二）、基因工程干扰素的制备; α2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子培养基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。; 发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaC