片仔癀对保护肝损害作用研究.docVIP

片仔癀对CCL4肝损害的保护作用研究作者：姚大卫 图1 小鼠肝细胞情况 a 正常组 b 片仔癀组 c CCL4组 d 片仔癀组+CCL4组 2．2 利用分子生物学技术研究片仔癀对肝细胞的保护作用机理采用分泌碱性磷酸酶化验以测定片仔癀对肝细胞的反应因子形成的影响。片仔癀对肝细胞作用的传导剖面分析是用汞牌通道剖面系统铡定的。相关因素：API、NFκB、E—box、CRE、GRE、SRE和HSE，这些反应因子均和一个TAL 的促进器和分秘碱性磷酸酶报告器相关连。把肝细胞播种在96格的培养盘中，通过Lipofect AMINETM2000，把300ng每单位构成物与5OμL的DMEM 培养基和0.4μL的LF2000混合传进培养盘的每室肝细胞中。传输物在传进培养盘24h后取出，一个培养盘加进新鲜的含有500μg/ml片仔癀的DMEM 培养基，一盘加进新鲜的未含有片仔癀的DMEM 培养基。培养48h后，25μL的表层浮物从96格的培养盘每格中取出。一套SEAP检测剂(Clontech)用来测定在表层浮物中的碱性磷酸酶的浓度。所有的化验均在一个白色96格的平底微滴定盘中进行。在每个25μL的表层浮物中加进25μL 的稀释缓冲液并混合均匀，混合物在65℃孵化30min，加lmM MUP3μL继续在暗室室温下孵化60min，然后测定SEAP的能力。 3、实验结果 3.1 片仔癀对小鼠CCL4急性肝损伤血清转氨酶的影响（见表1） 如上表所示，CCL4模型组小鼠的ALT和AST异常升高，片仔癀0.5g/Kg对CCL4肝损害造成的转氨酶升高有显著的降酶作用。 3.2 片仔癀对CCL4急性肝损伤所造成肝组织病理变化的影响 肝脏组织病理切片观察：CCL4模型组，肝中央静脉瘀血，周围有小叶中央性坏死，部分为小叶周围性坏死，呈点状和碎片状坏死，有灶性淋巴细胞等浸润；坏死周围有肝细胞重度浑浊肿胀、脂肪变性和气球样变性，汇管区有少量淋巴细胞等浸润，肝细胞的放射状排列被破坏。而片仔癀治疗组，被破坏的肝组织得到部分恢复，中央静脉周围肝细胞质红染，点状和碎片状坏死极少，大部分只表现有不同程度的肝细胞气球样变性，汇管区周围肝细胞有轻度浑浊肿胀，显示由CCL4引起的毒性已大大减少（见图1a、b、c、d）。 3.3 片仔癀对肝细胞重要信号传导通道各种反应因子的影响（见图2）。 ? 从上图所示表明，片仔癀500μg/ml能显著增加AP-1、CRE及NFκB反应因子水平，但对GRE、HSE、NFAT及SRE反应因子未能产生有意义的反应。 4、讨论 这个研究中，我们仔细观察了片仔癀对CCL4引起肝损伤的保护功能。组织观察显示CCL4引起肝脏细胞广泛的坏死变化，但若在小鼠受到CCL4侵害之前，给小鼠喂食片仔癀，这些坏死变化大大减少，研究结果表明片仔癀能够保护肝脏免受肝毒素的损害。肝功能测试也显示片仔癀能够保护肝脏：小鼠在受到CCL4侵害后，血清中的ALT和AST水平均异常地高，而预先喂食片仔癀的小鼠这种水平却大大降低。 为了进一步了解片仔癀的保肝作用，我们用解剖技术研究了片仔癀对重要信号传导反应因子的影响，以便了解片仔癀治疗作用的分子机理。研究发现片仔癀能够刺激AP-1、CRE及NFκB反应因子，这些因子在细胞的活动中起着重要的调整作用。细胞质中NFκB转进细胞核总是和细胞生存相联系的。曾报道过在部分肝切除后NFκB受抑制导致肝细胞相分离和肝功能降低，因此片仔癀提升NFκB能力，可能是保护肝脏免受毒素损害的原因之一。AP1是异二聚物形态，由Fos和Jun族抄写因子成员间组成，现在研究发现AP1的活动能力对肝脏再生起着关键作用，片仔癀能够刺激AP1反应因子，这可能是保护肝脏免受CCL4损伤的另一个原因。CRE的作用目前还不清楚，有报道它其中一个功能是在肝再生过程中调节LDHA基因。 总之，通过上面研究发现片仔癀能够对CCL4引起的肝损害有显著的保护作用，且其保护肝脏的作用可能通过刺激肝细胞重要信号传导通道各种反应因子而产生的。 本实验由香港中文大学生物医学学院医学解剖系前主任、英国皇家生物学院院士姚大卫教授负责完成，本文系姚教授发表在著名国际医学学术期刊丹麦的《药理与毒理》杂志的中文翻译。