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血红蛋白的提取和分离 基础知识 蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分了的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。在本课题中，我们将学习蛋白质分离方法中的凝胶色谱法。 (一)凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离(图5—13)。 相对分于转小的蛋 相对分彳较大的蛋 a·相对分予质量较小的蛋Fi质由于扩敞作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 b-(1)蛋白质混合物』i柱；(2)洗脱开始，相对分子质趋较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外；(3)相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较犬的蛋白质向下移动；【4)相对分子质量不同的分子完全分开；(5)捌对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 图5一l3凝胶色谱法分离蛋门质的原理 (二)缓冲溶液 缓冲作用在日常生活中并不少见。例如，运动鞋的鞋底富有弹性，能够缓冲外力，减少运动员受伤的几率(图5—14)。那么，缓冲溶液的缓冲作用体现在哪里呢?在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。缓冲溶液通常由l～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。 (三)电泳 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基 图5—14运动鞋的鞋底具有 缓冲作用 团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分了会向着与其所带电荷相反的电极移动(图5—15)。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 带电性质、分子t^；=小和形状的不同，使分广迁移速度不同 缓冲溶液支持胶体的玻璃板 图515正在进ff的电泳(左)和凝胶电泳原理示意幽(右) h 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N一甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶(图5—16)。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 蛋白质的提取和分离‘般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同会有很大差异。在本课题中，我们主要学习初步分离蛋白质的方法。 (一)样品处理 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90％是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成(图5—17)，包括两个O【一肽链和两个p一肽链。其中每条肽链环绕一个Ⅱ铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。本课题可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。 1．红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500 r／rain离心2rain，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0．9％的NaCl溶液