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第四章细胞的破碎与分离教学基本要求：1. 掌握细胞破碎的概念。2. 熟悉和掌握细胞破碎的各种方法。时间安排：3学时。教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT课件讲课。教学内容：由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取。细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。破碎率及其测定方法：破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比。测定方法：直接测定法和间接测定法。细胞破碎方法分类1)机械破碎法（高速珠磨法、高压匀浆法、超声波法等）2)非机械破碎法（化学法、酶解法、渗透压法、冻融法、干燥法等）机械破碎法：一、固体剪切方法（珠磨）：1、定义—利用由高速转动的珠子所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程2、工作原理：固－固剪切力、液－固剪切力等。3、影响因素：?转盘外缘速度：速度增加，破碎率增加，但功率-，温度-?珠粒添量和大小：要适度?温度：但研磨产热，功率-，温度-。如产物热不稳定，必须控温。?细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗-。?流量Q：破碎为一级反应。Q-, E-，Rˉ；Qˉ，Eˉ，R-。二、高压匀浆法（液体剪切方法）1、定义—利用高压细胞悬浮液因减压所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程2、工作原理：液－液剪切力、压力差等3、影响因素：?通过匀浆机的次数?温度：高温使破碎率增加但高温使产物变性?压力：高压使破碎率增加但高压使能耗增加，且会使机器破损。在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; 二者均具有适用对象广，工业化、实验室中应用，细胞完全破碎等优点。高压匀浆机最适合于酵母和细菌;珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适。三、超声波法1、定义—利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程2、工作原理：空穴现象，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。3、特点：?优点：适合于多种细胞的破碎?缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、珠粒体积和直径、被处理悬浮液的体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。非机械破碎法一、化学（脂溶）法：1、定义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，使内含物有选择性地释放出来的过程。2、原理：?酸碱：改变溶液pH值，从而改变两性产物蛋白质等的电荷性质?有机溶剂：如甲苯，被细胞壁脂质层吸收后，导致细胞壁膨胀，细胞壁破裂。?表面活性剂：二、酶解法1、定义—利用酶促反应分解细胞壁上的化学键而达到细胞破碎的过程2、原理?外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、 β –1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等。?内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等。3、化学法与酶法的优点：A、产品释放的选择性；B、提取速度和收效高；C、产品的破坏小；D、对外界环境，如pH和温度等要求低；E、不残留细胞碎片三、物理法：1、渗透压法：细胞经高渗溶液，如一定浓度甘油或蔗糖溶液处理，使之脱水收缩，然后转入水或水溶液，因渗透压突然变化，细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液中。2、冻融法：细胞在低温（-15度）下冷冻，然后在室温下融化，反复多次而使细胞破裂。3、干燥法：细胞用不同的方法干燥，细胞膜渗透性发生改变而破裂。然后用有机溶剂缓冲溶液抽提胞内物质。四、机械法和非机械法的比较1、机械法法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离。2、非机械法缺点：A、费用高；B、引起新的污染，尤其是其他化学方法；C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。破碎方法的选择一、选择的一般原则1、提取产物在细胞质内，用机械法破碎2、提取产物在细胞膜附近，用化学法3、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法二、破碎技术应注意的问题1、多种破碎方法相结合，杂交技术可产生很大优势。2、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化3、破碎技术与上游技术相结合：菌种的培育（过程和环境、胞内产物 ? 胞外产物）对破碎难易程度的影响三、存在的问题1、包涵体通过基因工程技术使一些基因在原核细胞表达时，蛋白质常常交联在一起，形成不溶性的聚积物，通常称为包涵体。2、包含体的解决方法（一般步骤）1)包含体的分离：细胞破碎，然后离心。2)包含体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDS3)变形蛋白质的复性和重新氧化：分子伴侣-催化及维持其它蛋白质正确构象的一类蛋白质分子，它参与