外植体的灭菌.PPTVIP

第三节　污染原因和预防措施 一、污染的原因 污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。 细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1-2天即可发现。 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。 真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3-10天才能发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。 6．操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行 * 二、污染的预防措施 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。 现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施。 1．防止材料带菌的措施 （1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。 枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水 抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。 或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待 抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明 显减少污染。 （2）选择合适的时间去田间采取外植体 避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。 但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。 2．外植体的灭菌 （1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在），同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌30min；第3，在无菌蒸馏水中冲洗3次；第4，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第5，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后，用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一周还应增加1次灭菌处理。 （2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片； 第2将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟； 第3在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min 第4放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌5—10min； 第5，用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 3．玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。 4.金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进 行。 干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121?C的温度，灭菌20 min～30min。 4．布质制品的灭菌 ５．无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。