PFGE原理和参数设置.pptVIP

PFGE分型技术和技术参数设置;PFGE原理及相关参数;PFGE原理及相关参数;PFGE原理及相关参数;目前常用的脉冲场凝胶电泳仪器为箝位匀强电场系统（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF） 方框代表琼脂糖凝胶，一排长方形小框代表DNA加样孔，六边形代表CHEF系统的电极（4X6）。当电泳工作时，DNA分子以箭头方向迁移。;影响分辨率的因素;脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。 例如：脉冲时间为30s，即电场方向将会在30s变换一次。脉冲时间是脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范围值如：2－20S。这样是为了使一定范围内的DNA片段都可以得到理想的分离。这种脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换的；而非线性的变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使相应大小的片断得到更好的分离。;脉冲时间—不同脉冲时间对带型的影响;电场夹角;120°;电场强度;缓冲液类型;电泳温度;琼脂的种类以及琼脂的浓度;电泳时间;基因组DNA的制备;PFGE操作基本流程;PFGE操作的基本流程—革兰氏阴性菌;PFGE操作的基本流程;PFGE聚类分析原则;TENOVER原则与聚类分析;基本原则;在使用细菌分型的结果进行暴发研究时是基于以下几个假设的： 1. 属于一次暴发的分离株来源于同一个祖先 2. 这些菌株应该具有相同的基因型 3. 流行病学无关的菌株应该有不同的基因型别 实际上某些流行病学无关的菌株同样会有相同或者相似的基因型。例如大部分的耐青霉素的金葡菌来源于少数几个祖先。所以一次暴发的菌株可能很难与本来存在的院内感染的金葡菌区分。;基因事件与条带变化;无法区分：分离株有相同的带型，包括条带的数目和位置。这些分离株为同一菌株。 高度相关：如果PFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化，这些菌株就被定义为高度相关菌株。这些仅有两到三个条带变化的情况常见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株。 可能相关：PFGE带型与爆发菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条带变化。（通常是4到6个条带的变化）。这些分离株可能是遗传上相关的，但是并不是紧密相关的，其流行病学关系也并不紧密。 这样的突变常见于分离自较长的时间段（大于等于6个月）或者是大规模延伸爆发的病人中。 无关：三个独立的基因事件引起的条带变化（7个或者是以上的条带变化）。;TENOVER原则的聚类方法;TENOVER原则的问题;TENOVER原则的问题;只有带型相似性在100%的菌株才可能是暴发菌株。;聚类分析;PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法，然而一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月，分型研究就转化为种群研究。而另外一些技术，如MLST，主要用于监测微生物种群随时间的变化。管家基因的突变是中性突变，不受环境选择压力的影响。 近来，这两种方法经常被结合起来用于细菌的分型研究。这两种方法的结合使用所获得的信息，有助于我们弄清楚暴发菌株是如何扩散的，以及各细菌种群是如何时间的变化的。;谢谢！