血红蛋白的提取和分离(经典).ppt

(一）蛋白质;4、基本组成单位;氨基酸的结合方式;;;;;8、分子结构;10、生理功能;①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个;③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构;④关于蛋白质相对分子量的计算： n 个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为______________;血红蛋白; 思考1 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？; 本课题学习目标;;原理：;4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程;凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示;二、缓冲溶液;三、 电泳---血红蛋白的分离鉴定方法; 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。 ;;; ; 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面，B为剖面）1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.73：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3;①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。;【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是 A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同 C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D.以上说法都正确 【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点： (1)凝胶色谱法的原理； (2)电泳法的原理。;二、实验步骤;实验操作;血液;血红蛋白;采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）; （1）红细胞的洗涤 A、洗涤目的: B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？ ;初次离心后的结果;（2）释放血红蛋白;磁力搅拌器;搅拌器转子;搅拌器正在工作;（3）分离血红蛋白溶液： ;甲苯层（无色透明）;柜式离心机; 2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）;;透析过程动画演示;（1）凝胶色谱柱的制作;凝胶色谱柱的制作 ;（2）凝胶色谱柱的装填; 教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？;装配好的凝胶柱;(3）样品加入与洗脱;注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。; ;;3.样品的加入和洗脱;①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ） ④再调整缓冲液面洗脱： ⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时收集;4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。 1、垂直板电泳装置 2、稳流稳压电泳仪； 3、微量进样器（可用微量移液器代替） ;（1）、 胶板的制备： ①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 ②.把玻璃板在灌胶支架上固定好;（2）、分离胶的制备：;（3）、 浓缩胶的制备：;（4）、取样 　 　取纯化后的血红蛋白样品10μ L加入10μ L上样buffer（内含少许溴酚蓝的40％蔗糖 ）混匀。;（5）装槽、点样：;;（6）电泳： ;（7)、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。;(8)、结果; 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。;影响蛋白质分子运动速度的因素;思考下面的问题：;【典例2】(2011·扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：;(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有____________功能。 (2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A