DNA重组技术和定点突变在生物酶工程中研究应用进展.docVIP

DNA重组与定点突变技术在生物酶工程中的研究进展 2005414 刘小艳 动物遗传育种 摘要 本文简要介绍了DNA重组技术与定点突变技术，着重概括了它们在多种酶研究中的应用状况 关键词 DNA重组 定点突变 酶 研究进展 生物酶工程又称高级酶工程。它是在化学酶工程的基础上发展起来的，是酶学与DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物[1]。随着计算机技术、化学理论以及蛋白质结构与功能相互关系的研究进展，生物酶工程技术会得到了越来越广泛的应用。 DNA重组技术在生物酶工程中的应用 DNA重组技术 对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（DNa recombination）[2] DNA重组是由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触而传递大段DNA遗传信息的现象，称为接合。细菌和放线菌均有接合现象。高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组[3]。1977年美国科学家首次用重组的人长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。此后，运用基因重组技术在生产新型酶等领域中取得了很多成果，预计下世纪将发挥更大的作用。 DNA重组技术在酶研究中的应用 1.2.1 质粒介导的AmpC酶 AmpC酶是一组头孢菌素酶，不被克拉维酸所抑制，多数由染色体介导，主要见于阴沟肠杆菌，费劳地枸橼酸杆菌，粘质沙雷菌及铜绿假单胞菌，可被8内酰胺类抗生素诱导。然而，近年来出现了AmpC~内酰胺酶由原来局限于染色体编码逐渐向质粒编码转移的趋势[4]。 质粒介导的AmpC酶在底物和抑制剂特性上，质粒编码的AmpC酶与染色体编码的AmpC酶相似，但其水解底物的范围更大。 1.2.2 重组谷氨酰胺酶(GA) GA是肿瘤细胞利用Gin进行酵解的起始酶和关键酶，肿瘤细胞内GA的活性直接影响细胞内Gin代谢的活跃程度[5]． 因此封闭GA基因就完全可能阻断肿瘤细胞内Gin的酵解，进而影响其生长和增殖等生物学特性，从重组质粒PGA104中获得目的片断0．2kbGAcDNA．反向克隆在PcDNA3．0的EcoRI和HindⅢ两酶切位点间，则构建出CMV启动子控制的大鼠GA反义真核表达载体。PCNA是一种核内蛋白。观察表明：反义GA重组质粒转染人结肠癌细胞后，细胞生长速度明显变慢，增殖期细胞明显减少最终造成肿瘤细胞生长受抑制[6]。 1.2.3 基因重组葡萄糖异构酶 葡萄糖异构酶能够催化D～木糖、D一葡萄糖等醛糖转化为相应的酮糖，是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键酶。高果糖浆是自60年代崛起的新食糖资源，在全世界范围内尤其是在发达国家发展极快，现美国的高果糖浆消费量已与蔗糖持平，而我国是一个缺糖国家，目前高果糖浆生产量和消费量较低。随着人民生活水平提高和国内饮料工业的迅速发展，我国已成为高果糖浆发展潜力最大的国家，基因重组葡萄糖异构酶的产业化将促进高果糖浆工业的发展并带来极大的经济效益[7]。 1.2.4 基因工程纳豆激酶 纳豆激酶(nattokinase)是日本学者须见洋行等人于1987年首次从纳豆中发现的。该酶是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆杆菌(Bacillus subtillis／rtatto)产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶 [8]。 近年来，国内许多学者热衷于纳豆激酶的研究，渴望将其开发成为新一代的溶栓新药。随着纳豆激酶分子生物学方面研究的不断深入，使研制基因工程纳豆激酶药物成为可能。利用基因工程技术，人们可以自由操作纳豆激酶基因。可以通过构建高表达载体，优化表达系统来提高纳豆激酶基因的表达水平[9]。 1.2.5 大肠杆菌中表达人胸苷激酶(hTK) hTK与细胞的增殖和分化密切相关。特别是在一些肿瘤病人的体液中明显增高，而在正常人的体液中hTK很微量。肿瘤病人体液中hTK的来源尚不十分清楚，推测可能是细胞破碎释放或瘤细胞分泌的结果。并且已证明肿瘤细胞内hTK也呈异常表达[10～12]。丁克祥等用DNA重组技术克隆了hTK基因，表达了hTK融合蛋白。结果显示hTK基因重组入PET28a+的EcoRI和