构建载体-个人总结难点.doc

构建载体 （一）流程图示 根据目标片段设计扩增引物（片段大于1kb时，同时设计测序引物） PCR扩增目标片段 抽质粒载体（扩增外源DNA片段）→检测DNA的质量（琼脂糖凝胶电泳/吸光度）→酶切载体与外源DNA→载体的去磷酸化→连接载体与外源DNA→制备感受态细胞→连接子转化感受态细胞→重组子筛选及鉴定（PCR检测，酶切检测，测序检测）。 （二）具体步骤及相应原理 质粒抽提 原理 细菌培养物的生长（从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可）→细菌的收集（离心）及裂解（离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法，方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）→质粒DNA的分离和纯化 （1）碱裂解法 solution I ：重悬细菌 solution II：其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开 solution III： 中和作用，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。 Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mMEDTA 10 mM 螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基\;EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境 RNase A 100 μg/ml 建议：检查配送的RNAse A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNAse A后，Buffer A1/RNAse A应该存放在4度，如果存放时间过长，或者没有正确存放，请重新加入RNAse A； Solution II: NaOH 0.2 M(促使染色体DNA与质粒DNA的变性) SDS 1 %(变性沉淀蛋白质,但SDS抑制核糖核酸酶，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。) Solution III（Final concentration）: NaAc 1.32 M Using HAc to adjust pH to 4.8 NaAc的水溶液呈碱性(PH=4.8), 必须加入大量的冰醋酸,所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 TE (pH 8.0) Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0） 1 mM 氨苄青霉素（ampicillin）：其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100 μg/ml)； 卡那霉素（Kanamycin sulfate）：核糖体结合抑制蛋白质的合成（使用浓度：50 μg/ml)； RNaseA: C或U的3’－P与相邻的5’－OH处切开。 配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于－20℃。 Note：在具体配置抗性LB时候，一般按照千分之一的比例加入，即350mlLB中加入350ul抗性溶液（于-20℃保存）； 2）具体步骤 一般地，先打电转获得含有相应载体的大肠杆菌菌液： 取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落（37℃过夜培养）； 用枪头or无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，（250 r/min，37℃摇床过夜培养）；(在具体的操作过程中，直接刮取质粒) 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净（尽量使用2ml离心管）； 加入300(l 溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块），可以使用牙签便于震荡，但菌体较少时不要