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浅谈食品微生物检验中ATP发光法应用摘要：本文就ATP生物发光法的检测原理、检测步骤、特点、检测的影响因 素及在食品工业中的应用进行了综述，并提出了目前ATP生物发光法检测中存在 的问题。 关键词：ATP 生物发光法；荧光素；提取剂；温度；检验 1 ATP 的理化性质 1.1 ATP广泛存在于各种活的生物体中,活的菌体中也含有ATP。细菌死亡后,在细 胞内酶的作用下,ATP将很快被分解掉。ATP是高能磷酸化合物的典型代表。ATP 是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸，其分子结 构式如图1所示。 图1 ATP分子结构式 1.2 ATP有两个高能磷酸键，一个低能磷酸键。每个高能磷酸键水解时，可产 生30．54kJ／mol的能量。ATP是细胞内特殊的自由能载体，广泛地存在于细胞内， 如细胞核、细胞溶胶、线粒体等。易水解，且水解时可释放出大量的能量，但水解易受细胞内环境的pH、Mg2+浓度等的影响。 2 ATP生物发光法检测的原理及一般步骤 2.1 ATP普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能，称作为“能量货币”。当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，ATP很快被分解掉。因此， 测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。ATP生物发光技术产生于20世纪70 年代中期。1983年，Moyer等最早提出细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性 和活细胞的数量。同年Gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细 胞活性度的检测方法。McElroy[最先引入荧光素酶．ATP检测法，其反应机理为： 在Mg2+存在下，萤火虫荧光素酶以D-荧光素酶、ATP、O2为底物，将化学能转化为 光D-荧光素+ATP+O2 Oxy-荧光素+AMP+PPi+H2O能，发出光量子，其发光 强度(I)与ATP浓度(CATP)符合下列函数关系。 式中，Imax为最大发光强度；Km为1×1O-4。由上式可知，当CATP远小于Km时， I正比于样品中的CATP。因此可通过测定发光体系的I来定量ATP浓度。 2.2 每个细胞的ATP含量大致是一定的，如大肠杆菌是1．4×10-18mol/细胞，乳酸菌是1．9×10-18mol/细胞，则由此可以推算出细菌数量。但由于实际检测中除 含有细菌外，还含有酵母等其他微生物，而酵母菌中ATP的含量通常是细菌中ATP 含量的100倍左右。因此，若同时又全部换算成酵母菌的活菌数量，则样品中活 菌数应介于二者之间。 2.3 此外，曾有学者以生物量C／ATP来推算生物量。Karl等研究了浮游植物的生 物量与ATP含量之间的关系，发现单细胞微生物的生物量C／ATP的平均比值为 250，而多细胞有机物的生物量C／ATP则小于1O0。还有学者预计通过测定ATP／ CFU的大小来预测样品中所含菌种类别，若ATP／CFU较小，则样品中可能主要含 有形态较小的G-细菌或孢子；若ATP／CFU较大，则样品中可能主要含有酵母菌或 形态较大的G+细菌。 2.4 ATP生物发光法的检测步骤大体包括：取样、样品ATP的萃取、添加荧光素．荧 光素酶、测定生物发光量、求出ATP浓度和活菌数。通常，样品未经处理是不能 测定ATP的。测定时需先将样品与ATP提取剂混合，使细胞膜和细胞壁溶解，释放 出ATP。ATP提取剂是以表面活性剂为基质的专用试剂。然后，提取出的ATP再与 荧光素-荧光素酶生物发光剂作用，用发光检测仪测定ATP与发光剂反应的生物发 光量。通过预先测定的ATP标准曲线，得出活菌的总ATP量，即可得出细菌总数。 3 ATP生物发光法的特点及应用 3.1 ATP 生物发光法的优点主要是快速、简便、重现性好；而由于其要求样品中 细菌浓度最低不少于 1000 个／ml，使得灵敏度有时达不到卫生学要求。此外， ATP 生物发光法不能区分微生物 ATP 与非微生物 ATP；并且由于食品本身、ATP 提取剂等含有离子，某些离子又会对 ATP 的测定造成干扰、抑制发光作用等。 3.2 ATP生物发光法的应用范围十分广泛，现己应用于食品工业的众多领域。例 如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。研究表明，ATP生物发光法与 标准的细菌培养菌落计数法相比，二者具有良好的相关性(r=0．98)。此外，ATP 生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱 水蔬菜的细菌学测定等。实验表明，ATP生物发光法与传统的琼脂平板法均具有 高度的相关性。 3.3 食品生产环境的清洁度检测是HACCP的重要内容。HACCP是指在食品生产和流 通的整个过程中，对可能发生危害食品安全之处进行分析，确定出应重点进行卫 生管理之处，并在此处