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吸附了鱼精蛋白的磁性纳米粒子能从人体血浆样本中高效分离和浓缩丙肝病毒阿卜杜拉A.亚辛，?艾哈迈德·M. Elwaseef，?麦格迪M. Elnashar?，?约翰内斯·奥尔登堡，?君特·梅耶，?贝恩德P?tzsch?和?延斯·穆勒?2013年9月5日?收到， 2013年11月3日接受文章来源：/chemcomm吸附了鱼精蛋白盐的柠檬酸化的超顺磁性氧化铁纳米粒子是一种能从血浆样品捕获和浓缩丙型肝炎病毒，从而提高通过核酸检测的下游分析的灵敏度的有效工具。丙型肝炎病毒（HCV）是世界上传染性最强的慢性血源性传染病的代表。据估计，全球有超过1.7亿人感染HCV，每年有3至4万新感染病例。在一般情况下，该疾病与急性和慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌相联系。目前丙型肝炎病毒感染的标准护理治疗包括干扰素，利巴韦林和最近批准应用的蛋白酶抑制剂。在一般情况下，治疗的成功与否是通过监测（减少）以最终实现病毒基因组的非可检测的水平为目标的核酸扩增检测（NAT）的丙型肝炎病毒的循环浓度来评估的。然而，“检测不到的水平”的定义取决于所应用的NAT-系统的较低检测限（LOD），也就是能够产生积极成果的95％的情况下（95％截止）的丙型肝炎病毒RNA的浓度。因此，在临床试验或治疗监测中，应用不同的测试系统对药物效率或治疗成功的评价可能会产生不一致的结果。因此，更灵敏的测试系统将允许对这些问题的更深入的看法。在用于检测的NAT-方法和提供HCV-RNA的定量方法之间，实时反转录（RT）-PCR（实时RT-PCR）是最常用的。作为适用于所有方面的NAT-方法，该实时RT-PCR检测的诊断灵敏度严格依赖于应用的上游目标纯化程序的效率。除了从高浓度血浆样品中直接分离??RNA，另一种提高血源性病毒基因组检测的灵敏度的有效方法，是在血浆样品的离心分离之前进行核酸纯化。然而，在HCV感染的情况下，这种方法的表现是有限的，因为HCV颗粒结合到（非常）低密度脂蛋白（VLDL / LDL）上，具有宽的密度分布，因此不作为有效丰富像B型肝炎或人类免疫缺陷病毒的底部馏分的方法。此外，该方法是费时的，限制了它在常规的测试中的使用。先前已表明，除其他（模型）的病毒，细胞培养的HCV结合了阳离子聚乙烯亚胺（PEI）后能在微米尺度与磁珠共价结合。据推测，这种结合是基于PEI-分子与病毒和/或形成的免疫复合物的带负电荷的表面的脂质或蛋白质的相互作用。因此，我们假设，正向包覆的纳米微粒，由于其高表面积与体积比，可能是一种有效的用于从像人血浆一样的复杂的样品中分离和浓缩丙型肝炎病毒的替代品。超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIONs）是由共沉淀的铁和三价铁盐合成的，并通过柠檬酸稳定保持表面上的净负电荷（见ESI??的方法细节）。因此，CNPS被发现能作为稳定的胶体溶液存在（图S1，ESI??）。柠檬酸化SPIONS（许可证）的傅里叶表征变换红外光谱（FTIR）表明了预期的结构完整性，同时用透射电子显微镜（TEM）分析表明，平均粒径11纳米，表示从8纳米至14纳米（图窄幅S2和S3，ESI??）。为了提供一个阳离子涂料，并就拟成本效益和易用性，我们决定测试高度正电荷的盐酸鱼精蛋白（鱼精蛋白）的简单的被动吸附产生的纳米颗粒。虽然其他正电荷的蛋白质可能也能达到这个目的，但我们还是决定使用鱼精蛋白，因为其规模相对较小（3-5 kDa的），它的高的等电点（10-13）及其在高浓度的医用级的可用性，能确保高批量一致性。众所周知的，具有一个净正或负的表面电荷的纳米粒子能有效地吸附不同种类的血浆蛋白。然而，潜在的机制，这也取决于颗粒大小，都还没有解决，而且似乎不仅包括静电，还有疏水和/或亲水性相互作用。为了监测吸附阳离子鱼精蛋白的带负电荷的纳米颗粒的效率和稳定性，我们使用了α-凝血酶（凝血酶），凝血级联的关键酶。除了它的活性位点和定义了底物特异性酶凝的凝血酶的两个阳离子外部位点。以前也已表明，凝血酶在生理pH中拥有净正电荷。相应地，我们发现，在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH值7.4）中纯化的凝血酶能有效地结合到带负电荷的纳米颗粒上，在培养和纳米颗粒的磁选后进行残余凝血酶的酶活性的测定（后上清液作为测定图1A）。图1? CNPS和PaNPs的表征。（一）在指定的终浓度中结合凝血酶(10 ng /ml)和CNPS。（B）接种于磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中具有或不具有在鱼精蛋白的存在或不存在0.1％的BSA CNPS(1 mg /ml)。洗涤后，把颗粒在凝血酶的结合测定法进行了引进。残留凝血酶活性的磁选相比于对照后的百分比显示在y轴。（C）鱼精蛋白涂层的稳定性。鱼精蛋白吸附在CNPS而检测凝血酶结合之前不同生产批次的PaNPs水洗了0-5次。（D）CNPS和PaNPs分别在有或无血浆前孵化的凝血酶结合测定时引入。当CNPS在