实验7 食品中硫胺素VB1提取、纯化与测定分析.docVIP

实验七 食品中硫胺素（VB1）的提取、纯化和测定 一、目的与要求 了解硫胺素测定的原理和意义。 掌握荧光法测定硫胺素含量的操作要点和注意事项。 了解荧光分光光度计等相关仪器的使用方法。 二、原理与意义 食品中VB1的存在形式： = 1 \* GB3 ①常以游离态存在； = 2 \* GB3 ②复合脂形式存在（磷蛋白）； = 3 \* GB3 ③辅羧酶形式存在； VB1在绿色蔬菜、米糠、麦胚、花生、黄豆、牛乳、蛋黄和酵母中比较丰富，动物组织不如植物中含量丰富。 VB1为白色结晶，在中性、碱性条件下不稳定，易分解；在酸性条件下稳定，即使加热；易溶于水，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3。 样品经热稀酸处理，以提取维生素B1；如果样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离。如果所含维生素B1系游离态，可直接在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其它荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。 三、仪器、器材与试剂 仪器试剂 仪器 试剂 器材 高压蒸汽灭菌器 2台 盐酸 1瓶 研钵8cm 2个 恒温培养箱 1台 无水乙酸钠 2瓶 三角瓶100ml 20个 荧光分光光度计 1台 溴甲酚绿 1瓶 烧杯100ml 10个 组织捣碎机 1台 氢氧化钠 2瓶 烧杯50ml 10个 粉碎机 1台 淀粉酶 1瓶 移液管25ml 10个 可调电炉（电磁炉） 2～4台 蛋白酶 1瓶 脱脂棉 1包 蒸馏水发生器 1台 人造浮石 2瓶 Maizel-Gerson反应瓶 40个 乙酸 2瓶 容量瓶 1000ml 5个 氯化钾 3瓶 500ml 2个 氯化钙 2瓶 250ml 2个 铁氰化钾 2瓶 100ml 10个 正丁醇（优级纯） 2瓶 25ml 20个 无水硫酸钠 1瓶 盐基交换管 20个 白点滴板 10个 量筒50ml 10个 样品（绿色蔬菜） 溶液配制 0.3mol/L盐酸：25.5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml（配2L）。 2mol/L乙酸钠：164.0g无水乙酸钠，加热搅拌溶于水中，稀释至1000ml 25%氯化钾：250.0g氯化钾溶于水中，稀释至1000ml（配3L ，2L装入一个2.5L的大试剂瓶，用来配溶液；1L用来活化浮石 25%酸性氯化钾：8.5ml浓盐酸，用25%氯化钾溶液稀释至1000ml（配2L）。17ml浓盐酸，加入2L的25%氯化钾溶液中。 15%氢氧化钠：75.0g氢氧化钠溶于水中，稀释至500ml（塑料或橡胶瓶塞）。 1%铁氰化钾：1g铁氰化钾溶于水中，稀释至100ml，当天配制，棕色瓶内保存（不使用，用来配制溶液）。 碱性铁氰化钾：取6ml的1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至90ml。用时现配，避光使用。 3%乙酸溶液：120ml冰乙酸，加水稀释至1L；再加3L水（不使用，用来活化人造浮石）。 活性人造浮石：称取200g的40～60目的人造浮石，以5～10倍于其容积的热3%乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的热25%氯化钾溶液搅洗15min；然后再用3%乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子；热蒸馏水中保存。 0.1mol/L盐酸：0.85ml浓盐酸，用水稀释至100ml（不使用，用来配制溶液）。 0.01mol/L盐酸：0.1mol/L盐酸100ml，用水稀释至1000ml。 硫胺素标准贮备液（1mg/ml）：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，用0.01mol/L盐酸溶解稀释至100ml（冰箱中避光可保存数月，不入试剂瓶）。 硫胺素标准中间液（10μg/ml）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释100倍（1ml，定容100ml；冰箱中避光可保存数月）。 硫胺素标准使用液（0.1μg/ml）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍（5ml，定容500ml），用时现配（两组各配一次）。 氢氧化钠（0.1mol/L）：0.2g氢氧化钠溶于水中（或取2.5液1.3ml），稀释至100ml 溴甲酚绿溶液（0.04%）：称取0.04g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入0.56ml的0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，加水至100ml 四、操作步骤 1 样品准备 样品采集后用匀降机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）后于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。 2 提取 2.1取100ml三角瓶，精确称量记录一定量试样（估计硫胺素含量为10～30μg，一般称取2～10g试样），加入50ml的0.3mol/L（或0.1mol/L）盐酸，混匀，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解，121℃下30min 2.2 用2mol/L乙酸钠调其