赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶.docx

实验十九 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸α-丙酮酸 + L-谷氨酸α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙（红棕色，λ=505nm）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性。【试剂】 1．0.1mol/L磷酸二氢钾溶液称取KH2PO413.61g，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml，4℃保存。2．0.1mol/L磷酸氢二钠溶液称取Na2HPO414.22g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml，4℃保存。3．0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）取420ml 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。 4．基质缓冲液精确称取D-L-丙氨酸1.79g，α-酮戊二酸29.2mg，先溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液约50ml中，用1mol/L NaOH调pH至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml，4～6℃保存，该溶液可稳定2w。每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g或加氯仿防腐，4℃保存。配成200mmol/L丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。 5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼（AR）19.8mg，溶于1.0mol/L盐酸100ml，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。若有结晶析出，应重新配制。6．0.4mol/L NaOH溶液称取NaOH1.6g溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。 7．2.0mmol/L丙酮酸标准液准确称取丙酮酸钠（AR）22.0mg，置于100ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。此液不稳定，应临用前配制。丙酮酸不稳定，开封后易变质（聚合），相互聚合为多聚丙酮酸，需干燥后使用。8．待测标本病人血清或质控血清。【操作步骤】1．ALT校正曲线绘制：（1）按表19-1向各管加入相应试剂。表19-1 ALT各标准管的配制方法加入物（ml）123450.1mol/L磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.12.0mmol/L丙酮酸标准液00.050.100.150.20基质缓冲液0.500.450.400.350.302,4-二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.5混匀，37℃水浴20min0.4mol/L NaOH溶液5.05.05.05.05.0相当于酶活性浓度（卡门氏单位）0285797150（2）混匀，放置5min，在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“1”号管吸光度为该标准管的吸光度值。（3）以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门氏活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成校正曲线。2．标本的测定（1）在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37℃水浴预温5min后使用；具体操作按表19-2进行。表19-2 赖氏法测定ALT操作步骤加入物（ml）对照管测定管血清0.10.1基质缓冲液－0.5混匀后，置37℃保温30min2,4-二硝基苯肼溶液0.50.5基质缓冲液0.5－混匀后，置37℃保温20min0.4mol/L NaOH溶液5.05.0（2）室温放置5min，在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。【计算】测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在校正曲线上查得ALT的卡门氏单位。【参考范围】血清ALT：5～25卡门氏单位。【临床意义】ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。当肝脏受损时，此酶可释放入血，致血中该酶活性浓度增加，故测定ALT常作为判断肝脏受损指标。1．肝细胞损伤的灵敏指标急性病毒性肝炎转氨酶阳性率为80%～100%，肝炎恢复期，转氨酶转入正常，但如在100U左右波动或再度上升为慢性活动性肝炎；重症肝炎或亚急性肝坏死时，再度上升的转氨酶在症状恶化的同时，酶活性反而降低，是肝细胞坏死后增生不良，预后不佳。以上说明，监测转氨酶可以观察病情的发展，并作预后判断。2．慢性活动性肝炎或脂肪肝转氨酶轻度增高（100～200U），或属正常范围，且AST＞ALT。肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。其它原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高；某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。3．其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高，如骨路肌损伤、多发性肌炎等。【注意事项】1．丙酮酸标准液的配制丙酮酸不稳定，见空气易发生聚合