中国药科大学生化设计性实验报告参考——酵母RNA提取、组分鉴定与含量测定.ppt

实验六;【实验目的】; 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 RNA含量测定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物。; 反应产物在670nm处有最大吸收,RNA浓度在10-100μg/ml范围内,光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此,测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。;1.实验材料： 酵母粉?(或酵母片);3.实验试剂： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、 0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g 钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准 RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地衣 酚-铜离子试剂; 1.RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至100毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。; 2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟。制成水解液并进行组分的鉴定。;3.RNA的组分鉴定 （2）核糖? 取1支试管加人水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 （3）磷酸? 取1支试管，加入1ml水解液，加入5滴浓HNO3和1ml钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，说明磷酸是否存在。;4.RNA地衣酚法显色测定 （1)标准曲线的制作;（1)标准曲线的制作;(2)样品的测定取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行测定. (3)RNA含量的计算根据??得的光吸收值,从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，计算出制品中RNA的百分含量。;【注意事项】;定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效。因此可以改用钼酸铵试剂定磷。核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀。;【思考题】