小鼠核糖核酸酶抑制剂的高效可溶性表达与氧化抗性鉴定.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１１）：１７２３ ? 小鼠核糖核酸酶抑制剂的高效可溶性 表达与氧化抗性鉴定    葛　莹 　孙婧慧 　闫　征　王　楠 （中国医学科学院　北京协和医学院药物研究所　北京　１００００５０） 摘要　核糖核酸酶抑制剂（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＲＩ）是一种细胞内能够调节核糖核酸酶活性的 胞浆蛋白，在分子生物学涉及ＲＮＡ的实验中有广泛应用。商品化的小鼠ＲＩ（ｍＲＩ）宣称其可能具 有较高的氧化抗性。为获得ｍＲＩ在大肠杆菌宿主中可溶性活性产物的有效重组表达，构建了含 有ｍＲＩ编码基因的重组质粒载体，在几种不同工程菌中进行了ｍＲＩ蛋白的表达纯化，并观察了其 氧化抗性特征。简单的组氨酸标签融合，即可在蛋白酶基因缺陷的ＢＬ２１衍生的宿主菌中，经过 适当诱导，获得较高水平活性产物的可溶性表达。纯化后产量在４～８ｍｇ／Ｌ水平，接近其他种属 ＲＩ特殊优化表达系统的最高产量。该重组ｍＲＩ与重组人ＲＩ（ｈＲＩ）具有基本一致的核糖核酸酶抑 制活性和抗氧化作用，与前人推测的抗氧化特征不同。 关键词　核糖核酸酶抑制剂　原核表达　活性　氧化抗性 中图分类号　Ｑ７８６ 　　核糖核酸酶抑制剂（ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＲＩ）是广泛存 高效可溶性表达，高密度培养时产量为１５ｍｇ／Ｌ菌液或１ 在于动物胞浆中的酸性蛋白质，分子量约为５０ｋＤａ，其 ｍｇ／ｇ湿菌体，但操作复杂，需要更换培养液进行诱导。 氨基酸序列具有３０个左右全部处于还原状态的巯基， ＲＩ中的巯基很容易被氧化而导致蛋白丧失活性，因此 并含有亮氨酸重复序列（Ｌｅｕｃｉｎｅｒｉｃｈｒｅｐｅａｔ，ＬＲＲ），而 需在一定浓度的还原剂如二硫苏糖醇（ＤＴＴ）存在下保 其三级结构呈对称的马蹄形。ＲＩ能够抑制哺乳类动物 存和使用。由于巯基数量和位置等结构差异，ｈＲＩ的氧 胰核糖核酸酶（ＲＮａｓｅ）超家族中的多种成员，它与核糖 ［１１］ 化抗性仅为牛源的四分之一 ，而小鼠ＲＩ（ｍＲＩ）的氨 ［１２］ 核酸酶１∶１紧密结合，形成的复合体解离常数极低 。 基酸序列中并不包含如ｈＲＩ中对氧化作用敏感的相邻 天然核糖核酸酶抑制剂可从人胎盘以及一些哺乳动物 ［１２］ 半胱氨酸残基 。基于文献，商品化的重组ｍＲＩ（Ｎｅｗ 组织中提取分离纯化［３６］。其他哺乳动物如牛、猪、羊、 ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＭ０３１４）说明书中推断，与 ｈＲＩ相比， 小鼠和大鼠来源的 ＲＩ，均具有与人胎盘 ＲＩ相近的 ｍＲＩ不含易氧化的相邻巯基，应具有更高的抗氧化失 ［７］ ＲＮａｓｅ结合特征和较高的基因同源性 。 活作用，可在低浓度还原剂条件下保持活性。 　　使用基因重组方式在大肠杆菌及其他宿主中表达 ［８１０］ 　　尝试在大肠杆菌宿主中对重组 ｍＲＩ蛋白进行表 人、大鼠和猪ＲＩ已经获得成功 。以大肠杆菌为宿主 达，以获得可溶性的活性蛋白产物，并进一步对ｍＲＩ的 的重组蛋白原核表达方法，更为常用。但是，ＲＩ基因在