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微生物检测方法学验证方案 文件编号：P- 批准签字页方案起草 岗位/职位 姓名 签字 日期 微生物岗/QC人员 方案审核 岗位/职位 姓名 签字 日期 微生物岗/组长 生产部/部长 质量部/QA监督员 方案批准 岗位/职位 姓名 签字 日期 总工 质量受权人  目录 1. 目的 4 2. 范围 4 3. 责任者及职责 4 4. 验证简介 4 5． 验证过程 7 6． 结果判断 8 7． 结论和建议 8 8． 异常情况报告 8 9． 再验证 8 10．附件 8 附件1：培养基的灵敏度复核 9 附件2：稀释液的无菌性检查 10 附件3：方法验证 11  目的 按照中国药典2010版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。 范围 本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。 责任者及职责 部门 职责 质量部起草并审核验证方案 进行验证试验的具体操作 完成验证记录中相关操作记录的填写 根据验证结果起草和审核验证报告 负责审核并批准验证方案和验证报告 质量部审核并批准验证方案和验证报告 监督验证方案的实施 验证简介 定义 CFU：菌落数 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 试验组 当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。 菌液组 稀释剂对照组 用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。 样品组 样品溶液 菌悬液 （50-100CFU） 稀释液 平均菌落数 (CFU/皿) 供试液对照组 + C供试液对照组 试验组 + + + C试验组 菌液组 + - C菌液组 稀释剂对照组 + + C稀释剂对照组 菌悬液 4.2.1菌种及来源 培养基名称 名称及代号 编号 批号 有效期至 来源 营养琼脂金黄色葡萄球菌 Staphlococcus aureus ATCC6538 ATCC 大肠埃希氏杆菌 Escherichia coli ATCC8739 枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis ATCC6633 玫瑰红钠琼脂白色念珠菌 Candida albicans ATCC10231 黑曲霉 Aspergillus niger ATCC16404 备注 检查人： 复核人： 检查日期： 4.2.2菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48h。上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。培养基及稀释液 4.3.1培养基和稀释液的名称 培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红培养基稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液4.3.2培养基灵敏度复核 培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》QC252 4.3.3稀释液的无菌性检查 对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。此操作可与其它试验同时进行。供试液的预处理 4.4.1样品名称及数量样品名称 量批号 Sn-A Sn-B Sn-C S01 ******中间制品 S02 *******成品 200g S03 原辅料1 200g S04 原辅料2 200g S05 原辅料….. 200g S06 消毒剂 ml S07 饮用水 100ml S08 纯水制备过程水 100ml S09 ……. 备注 检查人： 复核人： 检查日期： 4.4.2样品预处理方法中间制品 无需处理，原作为供试液。 无需处理，原作为供试液。 取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用…. 取10g样品，加入灭