I型IP3受体在自体中厚移植皮片中表达.docVIP

I型IP3受体在自体中厚移植皮片中表达[摘要]目的：检测I型1,4,5--三磷酸肌醇受体 (type I inositol 1，4，5-triphosphate receptor, IP3R1)在人自体中厚移植皮片中的表达，初步认识由IP3受体介导的钙信号转导在自体中厚移植皮片过度色素沉着发生机制中的作用。方法：利用免疫组化SP方法，检测IP3R1在自体移植中厚皮片、受区周围与供区正常皮肤中的表达并进行统计学分析。结果：IP3R1的表达定位于表皮基底部黑素细胞、角质形成细胞胞浆，在大部分自体中厚移植皮片中呈强阳性表达，与自体正常对照皮肤中的表达差异有显著性意义(P 1.2 主要试剂：I型IP3受体抗体（Santa Cruz 公司，美国）；SP免疫组化染色试剂盒，DAB 试剂盒（Sigma 公司，美国)等。 1.3 免疫组化步骤：皮肤标本经固定、脱水、石蜡包埋后。切成4mm石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的载玻片上。6O℃烤4～8h。将石蜡切片脱蜡至水，0.3%H2O2室温20min,PBS洗3次，加入0.01mmol/L，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液，微波处理2次(每次10min)，修复抗原，冷却后PBS洗2次。加I型IP3受体抗体1:100稀释，4℃孵育过夜，彻底水洗，加入1:200生物素化兔抗鼠IgG，室温30min，加1:400 StrepAvidin-HRP，室温30min。以上各步骤均经0.01mmol/L PBS（pH7.4）冲洗3min，3次；然后将切片置0.05% DAB+0.03%H2O2显色液中显色8～12min；蒸馏水，冲洗，苏木素复染1min；脱水，透明，中性树胶封片。全部标本用PBS做空白对照。 1.4 观察与结果判定：按照吕宏升[4]等提出的免疫组化定量分析图像采集方法要求，设定好参数，所有切片的照相工作均一次完成，采用专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.0测得切片上DAB显色为棕黄色代表阳性区域的光密度值，每张切片分别随机选取10个视野，测量光密度，取其平均值作为平均光密度值，并将以此代表实验所研究蛋白的表达强度进行分析。 1.5 统计学处理：采用SPSS11.5 统计软件包进行分析。实验组与两正常对照组的光密度值均以(x±s)表示。组间行配对t检验。 2结果 I型IP3受体主要位于黑素细胞、角质形成细胞胞浆，胞核亦有部分表达，呈黄色、棕黄色或棕褐色颗粒或团块，呈局灶性或弥漫性分布，苏木素复染胞核呈蓝色，背景清晰。在大部分自体中厚移植皮片中呈强阳性表达。在表皮基底层处形成棕褐色条带（图1)。I型IP3受体在自体移植中厚皮片实验组中表达的平均光密度值为0.47±0.07。在受区周围正常对照皮肤对照组中表达的平均光密度值为0.21±0.09。在原供区周围正常皮肤对照组中表达的平均光密度值为0.19±0.08。I型IP3受体在实验组中的表达与在两对照组正常对照皮肤中的表达差异有统计学意义(P [7]Schallreuter KU,Kothari S,Chavan B,et al. Regulation of melanogenesis- controversies and newconcepts[J]. Exp Dermatol,200 8,17(5):395-404. [8]孙大业.细胞信号转导[M].3版.北京:北京科学出版社,2001:93-118. [9]王静艳,吕飒,刘沛.IL-1 增强主动脉平滑肌细胞内I型受体表达[J].中国免疫学杂志，2003,19(12)821-824. [10]Tasker PN,Michelangeli F,Nixon GF. Expression and distribution of the type 1 and type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in developing vascular smooth muscle[J].Circ Res, 1999,84(5):536-542. [11]Vermassen E，Parys JB，Mauger JP．Subcellular distribution of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors：functional relevance and molecular determinants[J].Biol Cell,2004,96(1):3-17. [12]Mak DO,McBride S,Foskett JK.Regulation by Ca2+ and inositol 1,4,5-trlspho