基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术 fluorescence lifetime imaging based on time-correlated single photon counting.pdfVIP

第22卷第8期 强 激 光 与 粒 子 束 V01．22，No．8 POWERI，ASERANDPARTICI，E 2010年8月 HIGH BEAMS Aug．，2010 文章编号： 1001—4322(2010)08—173卜04 基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术’ 盛翠霞， 李田泽 (山东理工大学电气与电子工程学院，山东淄博255049) 摘要： 采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命，时间相关单光子计数采用多波长通道 同时记录荧光光子数，可以提高计数效率和信息量，还可以在稳态图像中分离不同荧光团，形成4维图像。并 采用多光子激发技术。利用长波长光源发出的两个或多个光子可以激发出一个短波长的光子。多个光子必须 几乎同时到达激发点，才能提供被激发分子足够的能鼋以产生荧光。多光子激发波长较长，生物组织对其散 射减小，因而可以穿透到更深层的组织，从而提高荧光成像深度和空间分辨力，并减少对活体样品的损伤。 关键词：荧光寿命； 时间相关单光子计数；多光子激发； 多波长成像 中图分类号： Q631 文献标志码： A doi：10．3788／HPLP1731 荧光寿命成像技术是利用合适波长的入射脉冲光对生物样品进行激发，通过测量生物组织中的自发荧光 发光强度衰减过程时间的不同，来获得荧光团分子内部的能级结构，同时可用来区分样品中的不同分子种 类[1≈]。由于自发荧光发光强度衰减函数定量图能对荧光分子团及其周围的环境产生很高的区分度，故荧光成 像技术在生物组织的功能性成像中特别有效。X射线是现在最常用的分析检测癌症和其它疾病的工具，但是 X射线的危险性和局限性是众所周知的，现在还没有一种安全技术能够代替它进行软组织成像。荧光寿命成 像由于其完全非侵入性、无损性、非电离化辐射，以及能够显示组织中各种化学组分，因而能提供有用的功能信 息Is]。荧光寿命成像技术是通过样品微环境内荧光寿命的测量以反映微结构与微环境的不同，因此需将荧光 寿命测量和显微测量结合起来，具有高的时空分辨力，能进行生物活体测量[4]。因此该技术在生物物理、生物 化学及临床医学诊断等领域具有较好的应用前景。国际上从20世纪80年代末才开始荧光寿命成像显微技术 方面的研究工作，但发展较快，并已取得一些研究成果。最早从事荧光寿命成像显微技术方面研究的是日本的 大阪大学。美国马里兰大学对细胞中的诸如Ca2+的浓度和PH值等参数的荧光寿命进行了深入的研究，德国 Max Planck研究所主要进行了荧光寿命成像显微技术的理论、方法及实验研究工作¨]。目前荧光寿命成像技 术采用的是单光子激发产生荧光，即采用激光共聚焦扫描显微镜。而且时间相关单光子计数(TCSPC)的计数 效率不是很高¨]。针对存在的这些问题，本文提出新的研究方法：将多光子激发技术和时间相关单光子计数相 结合应用于荧光寿命成像。 1荧光寿命成像理论分析 荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间，处于激发态的荧光分子在 退激发到基态的过程中发射荧光释放能量，激发态荧光团荧光强度的衰减用数学式表达为单指数函数 I(￡)一Ioexp(一三) (1) r 式中：J(￡)是样品受到光脉冲激发后t时刻测量得到的强度；，。是￡=0时的强度；r为平均荧光寿命，是分子的 特征值，定义为荧光强度衰减到初始值J。的1／e时所需要的时间[7]。实际上，荧光的发射是一个统计过程，很 少有荧光分子刚好在r(荧光寿命)时刻发射荧光，荧光寿命仅反映荧光强度衰减到其起始值1／e所需的时间。 荧光寿命的测量是荧光寿命成像的关键。因此荧光寿命成像质量取决于荧光寿命所采用的测量方法。荧光寿 命测量方法包括时域法和频域法，本文采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命。 1．1光子、光电子统计理论 在被测的微弱随机光场作用下，光检测计光阴极发射光电子，其行为可用双随机泊松点过程来描述