刺蒺藜血清对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成影响.doc

刺蒺藜血清对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成影响[摘要]目的：探讨刺蒺藜血清对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。方法：体外培养小鼠B16黑素瘤细胞，制备大鼠含药血清，分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和NaOH裂解法检测细胞增殖及黑素含量。结果：刺蒺藜对黑素细胞增殖及黑素含量具有低剂量(10g)抑制、高剂量(30g)促进作用(P0.05)． Conclusionsthe effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in B16 melanoma cells correlated with the concentration of Tribulus terrestris．It presented a two-way regulation on proliferation and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells． Key words：Tribulus terrestris；serum containing；proliferation ；melanogenesis 色素障碍性疾病是临床上常见的皮肤病之一，而黑素细胞产生的黑素是决定皮肤颜色的主要因素。刺蒺藜作为治疗色素障碍性疾病的常用药物，我们既往的研究发现不同浓度刺蒺藜水提物以及含药血清对酪氨酸酶（TYR）活性有高浓度激活, 低浓度抑制的作用[1-2], 提示临床治疗不同色素代谢性疾病时刺蒺藜的用量应有所不同。为进一步研究这一问题, 我们采用中药血清学方法研究低、中、高三种给药剂量所制备的大鼠血清对B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响，旨在为刺蒺藜治疗色素性皮肤病的理论研究提供科学的实验依据。 1材料和方法 1.1 黑素瘤细胞株及来源：人Ａ375黑素瘤细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。 1.2 试剂：MTT(四甲基偶氮唑蓝)、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Sigma公司），DMEM培养液（高糖）、10%胎牛血清（美国Gibco公司），其它试剂均为国产分析纯。 1.3 实验药物：①实验用药材刺蒺藜购自南方医科大学南方医院中药房，经南方医科大学中医系中药教研室严格鉴定；②补骨脂素（甲氧沙林片）由重庆华邦制药有限公司馈赠, 批号 1.4 实验动物：清洁级wistar雌性大鼠，体重200～250g，购自南方医科大学实验动物中心。 1.5 主要仪器：倒置显微镜（Nikon公司），自动酶标仪（芬兰Thermo公司）等。 1.6实验方法 1.6.1 中药水提取液的制备：刺蒺藜100g经鉴定后置砂锅内, 加相当于药材量的8倍的蒸馏水浸泡2h，煮沸30min过滤。药渣加5倍水继续煎煮，煮沸30min过滤。合并两次滤液，于水浴上分别浓缩成每毫升相当于原生药0.2g的中药药液。 1.6.2 补骨脂素混悬液的制备：取8-甲氧补骨脂素片5mg×6片，研磨成极细胞粉，加少量单蒸水，再研成糊状，加水10ml 再研，移入100ml量筒，再加水20ml研磨, 移入量筒，反复数次，直到将所有白色粉状物全部移入量筒。定容至100ml（0.3mg/ml），移入棕色瓶中，4℃保存备用。 1.6.3 大鼠药物血清制备：将30只雌性大鼠随机分成5组, 每组6只, 按60kg人每日白蒺藜30、20、10(高、中、低)三种剂量换算大鼠用量, 中药组三组随机给予0.2g/ml刺蒺藜水提液1.5/100g、1ml/100g、0.5ml /100g；阳性对照组给予0.3g /ml的补骨脂素混悬液（用前摇匀）；空白对照组给予等量单蒸水。每天上午给大鼠灌胃1次，连续灌胃7天，末次给药后1.5～2h，以 11%氨基甲酸乙酯腹腔注射（11g/kg）麻醉大鼠，无菌条件下，从腹主动脉取血，3 000r离心20min，分离提取血清，分离血清，经0.22μm滤膜抽滤除菌，分装后置于56℃水浴中灭活30min[3]，-20℃冰箱保存备用。 1.6.4 小鼠B16黑素瘤细胞的培养及传代：细胞以按4×104个/孔接种于96孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃及5% CO2下孵育常规培养，待细胞生长至80%左右融合状态，0.25%胰酶-EDTA消化，以每瓶约105个进行传代至25cm2，每3天传代1次。 1.6.5 黑素瘤细胞增殖的测定[4-5]：采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)，取对数生长期细胞常规消化，调整细胞为5×104个/ml，取100μl接种于96孔板，37℃及5% CO2下孵育24h后，分别加入含不同剂量药物血清的