大补阴汤含药血清对H460细胞生长抑制作用 .docVIP

大补阴汤含药血清对H460细胞生长抑制作用 李海波　李建春 摘　要：目的：探讨中药复方大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。方法：将小鼠随机分为正常组、生理盐水组和大补阴汤组，连续灌胃给药7天后，眼眶取血，分离血清；生物倒置显微镜观察细胞形态变化，MTT法检测大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。结果：大补阴汤作用H460细胞48h和72h以后，可见部分细胞变圆，体积变小，有凋亡小体产生。大补阴汤可时间依赖性抑制H460细胞的生长。结论：中药复方大补阴汤含药血清可以抑制H460细胞的增殖，为进一步探讨其抗肿瘤作用机制提供实验依据。 关键词：大补阴汤；血清药理；H460细胞 　　 大补阴汤为补益类中药复方，该方出自《丹溪心法》，是滋阴降火的代表方剂。全方由熟地黄、龟板、知母、黄柏和猪脊髓组成。临床常用于相应的气虚阴虚病证，体内用药多起到满意的疗效。近年来的临床实验研究发现。其对慢性再生障碍性贫血、顽固性失眠、出血性疾病及恶性肿瘤等疾病具有较好的治疗作用。本实验引入血清药理学方法(即体内实验和体外实验结合的一种方法)，用服药后的小鼠血清(含药血清)代替中药煎剂作用于体外细胞，研究中药复方大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。 1 实验材料 1．1 药品与仅器二氧化碳培养箱(HHCP－1，上海)，生物倒置显微镜(AE20，Mode)，96孔培养板(Nune，Roskil-如，Denmark)，胎牛血清(天津灏阳生物试剂公司)，RPMI一1640培养基(GIBCO)，甲基噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)。熟地黄、龟板、知母、黄柏(购自辽宁中医药大学附属医院药局)，猪脊髓(购自家乐福超市)。 1．2 实验动物昆明种小鼠30只(辽宁中医药大学实验动物中心提供)，雌雄各半，体重18-22g。 2　方法 2．1 细胞培养人非小细胞性肺癌H460细胞株(Ameri-can Type Culture Collection)，细胞单层接种在含5％胎牛血清，2％谷氨酰胺，RPMI-1640培养液中，在温度为37℃，C02浓度为5％的培养箱中培养。 2．2 中药复方液的制备大补阴汤(熟地黄15g，龟板15g，黄柏9g，知母各9g，猪脊髓)，上述中药复方药物成分，加水煎煮两遍，合并两次滤液，浓缩至每毫升含原中药复方成分生药1g。置4℃冰箱保存储备。 2．3含药血清的制备昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g。共分为3组，每组10只，雌雄各半，即空白组、盐水组和大补阴汤组。连续7天灌胃给药，每日1次，每次每只0.4mL/10g。上述连续灌胃7天的小鼠，于眼眶取血，静置后离心分离血清10min(2000r/min)，56℃水浴灭活30min，经0.221xm微孔滤器过滤除菌(按1：9的比例将培养液加入原血清中)后，冻存备用。 2．4 细胞生长抑制实验取处于对数生长期的H460细胞，调整细胞密度为5×104/mL，以每孔100μL接种于96孔板。置于5％CO2、37℃的培养箱中培养24h后，吸出培养液，分别加入培养液、盐水、大补阴汤的含药血清液，每组重复3个孔。之后继续置于5％C02、37℃的培养箱中培养，加药作用12、24、36和48h后，每孔加入10μL MTT(5g/L)，继续培养4h后，弃上清，每孔加入100μL DMSO溶解，酶标仪492nm检测，绘制时效曲线。 抑制率(％)=[A492(阴性对照)-A492(大补阴汤)]/A492(阴性对照)×100％ 2．5 细胞形态学变化每瓶1×106个细胞的密度接种于50mL细胞培养瓶中，培养24h后加入大补阴汤含药血清，分别于作用0、12、24、36和48h后用生物倒置显微镜观察。 3 结果 3．1 大补阴汤对H460细胞的生长抑制作用 大补阴汤于不同时间作用于H460细胞后，盐水组细胞的存活率随时间的增加而增加，而大补阴汤组细胞的存活率随时间的增加而减少。可见大补阴汤含药血清对H460细胞具有细胞毒作用并呈明显的时间依赖性。 3．2 细胞凋亡形态学观察光学显微镜观察，与正常对照组细胞相比，大补阴汤作用于H460细胞48h后，部分细胞变圆，体积变小，少量细胞表面发芽，细胞变成不规则状，芽脱落后形成凋亡小体，凋亡小体呈圆形或椭圆形，在凋亡小体内可见高度浓缩的染色质轮廓，作用72h后，可观察到凋亡的H460细胞数量增多，少部分细胞脱落，漂浮于培养液中，亦有少数细胞体积增大，细胞肿胀、破裂，呈坏死状。 4　讨论 血清药理学是近10多年来才逐渐兴起的一门实验方法学，是一种研究中药药效较为科学的方法。它是指将中药或中药