桂枝茯苓胶囊对体外人宫颈癌Hela细胞抑制作用及机理探究.docVIP

桂枝茯苓胶囊对体外人宫颈癌Hela细胞抑制作用及机理探究收稿日期:2009-11-06 基金项目:浙江省教育厅基金资助项目 作者简介:黄燕芬(1974-),女,浙江金华人,副教授,主要从事中药成分的分离与中药药理研究。 摘 要:目的:研究桂枝茯苓胶囊对体外培养人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用和作用机理的初步研究。方法:MTT比色法观察桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用;免疫组化检测Fas、Fas ?L、Bcl-2基因的表达;western-blot和RT-PCR检测对人宫颈癌Hela细胞Caspase-3蛋白和Caspase-3 MRNA的表达影响;DNA-Ladder检测凋亡条带。结果:桂枝茯苓胶囊对人宫颈癌Hela细胞有明显的抑制作用(P 2.2.2 免疫组化检测对人宫颈癌细胞Hela的Fas Fas-L BCL-2蛋白表达SABC法:取实验组6孔培养板里盖玻片,0.01MPBS漂洗3次,湿盒内10%中性福尔马林缓冲固定30分钟,PBS漂洗;H?2O?2+甲醇(1∶50)浸泡15min,PBS洗去浸泡液;加封闭液室温放置20min,甩去多余的液体;加一抗(Fas、Fas-L、Bcl-2 )37℃培养1h,PBS洗2min×3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)20℃,20min,PBS漂洗;加SABC(1mL蒸馏水+ABC各一滴混匀),20℃,20min,PBS漂洗。苏木素轻度复染,分别用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脱水每次2min、二甲苯透明,显微观察Fas、Fas-L、Bcl-2的表达。 2.2.3 western-blot检测对人宫颈癌Hela细胞caspase-3的表达抽提实验组25mL培养瓶细胞蛋白:加700μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,经常摇一摇,使细胞充分裂解。收集裂解液体,4℃,12000r/min离心5min,取上清分装Eppendorf管中。Lowry法测定蛋白浓度。? 取15μL左右(约含蛋白40μg)SDS电泳分离后电转移到硝酸纤维膜。取出膜用5%脱脂奶粉室温封闭2h后,用含 0.05%Tween 20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次,每次 10min,加兔抗人Caspase-3多克隆抗体(1∶1000)4℃孵育过夜,TBST漂洗3次后加相应的生物化素羊抗兔二抗(1∶500),37℃摇床温育2h,DAB显色系统显色,拍照。 2.2.4 RT-PCR检测对人宫颈癌Hela细胞Caspase-3的表达按TRIzol试剂说明书提取实验组25mL培养瓶细胞RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度,纯度要求为OD260/OD2801.8,将浓度调整为0.2μg/μL,提取的总RNA进行cDNA合成。? RT-PCR反应条件:混匀后42℃1 h,95℃加热5 min,快速冷却到4℃。反转录所得的cDNA用作PCR反应的模板,-20℃保存备用。PCR扩增反应体系及条件:Caspase-3∶94℃ 5min预变性,94℃45s,52℃45s, 72℃1min,30个循环; 72℃延伸10 min,产物4℃保存[4]。? 扩增产物经25 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统进行拍照分析。 2.2.5 DNA Ladder检测凋亡条带按DNA ladder抽提试剂盒说明书提取实验组25mL培养瓶细胞DNA,测定DNA浓度。? 取5μL样品加入1μL Loading Buffer,1.5%琼脂糖凝胶电泳75V/cm 电泳45 min,凝胶图像处理系统观察拍照。 3 结 果 3.1 对人宫颈癌Hela细胞生长抑制作用? 桂枝茯苓胶囊40μL时对Hela有抑制作用(?P? 1