EGF对真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK┐4表达的影响.docVIP

　　EGF对真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK┐4表达的影响 关键词:细胞周期蛋白类;细胞周期蛋白质依赖激酶类;表皮生长因子-尿抑胃素;真皮;成纤维细胞 摘要:目的探讨表皮生长因子（EGF）对作为皮肤组织工程种子细胞之一的真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK-4表达的影响，以从细胞周期探讨EGF促进真皮成纤维细胞生长的机制.方法用含100mL#12539;L-1胎牛血清的DMEM，加入50mg#12539;L-1的EGF培养SD大鼠的真皮成纤维细胞，通过MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态，免疫组化检测cyclinD1和CDK-4的表达，结合流式细胞仪分析观察细胞的周期变化.结果MTT检测、流式细胞仪结果都显示50mg#12539;L-1的EGF能显著促进真皮成纤维细胞的生长增殖，免疫组化结果显示，二者一致.结论50mg#12539;L-1的EGF对真皮成纤维细胞的生长有极大的促进作用，促进了细胞周期蛋白cyclinD1和CDK-4的表达，使细胞G1期变短. 　　Keyalgrois;fibroblasts 　　Abstract:AIMToexaminethebiologicalbehaviorsofder-malfibroblastsinDMEMcontaining50mg#12539;L-1EGFandtoinvestigatetheexpressionsofcyclinD1andCDK-4.METH┐ODSDermalfibroblastsg#12539;L-1EGFand100mL#12539;L-1fetusbovineserum.Theproliferationabilitymunohistochemistrymethod.RESULTSDermalfibroblastsculturedinDMEMcontaining50mg#12539;L-1EGFshoorepositivesignalsforcyclinD1andCDK-4.CONCLUSIONThedermalfi-broblastsculturedinDMEMcontaining50mg#12539;L-1EGFL#12539;L-1胎牛血清的DMEM再加入50mg#12539;L-1的EGF（该浓度为预实验结果）和仅含100mL#12539;L-1胎牛血清的DMEM. 　　1.2.2分离培养真皮成纤维细胞无菌条件下取SD新生仔鼠背部皮肤，去除皮下组织，用含抗生素的PBS冲洗，将标本切成1mm×1mm×1mm大小，置于2.5g#12539;L-1的胰酶中，4℃放置过夜，仔细将表皮与真皮分离，将真皮放入含培养液的离心管中终止胰酶作用，反复吹打，过筛网，收集分离的细胞悬液，台盼蓝染色法行活细胞计数，用上述两种培养液以（1×105～1×106）#12539;cm-2密度分别接种.待细胞长满后，用2.5g#12539;L-1的胰酶消化传代，用上述两种培养液分成两组培养. 　　1.2.3MTT检测在96孔板上以4×103#12539;cm-2的密度接种细胞.培养3d后，每孔加入MTT（5g#12539;L-1）20μL，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，充分振荡15min，酶联免疫分析仪测每孔A490nm值. 　　1.2.4流式细胞仪分析取细胞5×105个，800r#12539;min-1离心5min，弃上清，冷PBS洗涤2次，700mL#12539;L-1冷乙醇固定，4℃过夜.上机前离心去除乙醇，PBS洗涤2次，加入PI（溴化丙锭）染液1mL，4℃闭光染色30min，上机检测分析. 　　1.2.5免疫组化检测细胞中CyclinD1和CDK-4的表达细胞甩片经3mL#12539;L-1TritonX-100/PBS，10mL#12539;L-1H2O2/PBS处理后，正常兔血清封闭，37℃温育30min，分别滴加CyclinD1（1∶100）和CDK-4（1∶100）多抗，4℃过夜，次日晨滴加兔抗羊IgG血清，37℃温育30min，DAKO即用型二抗复合物，37℃温育30min（以上各步间均以PBS充分振洗），DAB显色，室温5min，PBS振洗中止显色反应，苏木精衬染，逐级乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片;阴性对照用PBS代替一抗，其他同前. 　　1.2.6免疫组化定量分析CyclinD1和CDK-4在细胞中的阳性信号为覆盖胞核、胞质的棕黄色颗粒（Fig1～4）.用免疫组化定量系统，对正常组和实验组进行测量，每次测量前，都以统一的空白片作标准，调整系统光度值，设定的标准灰度，在同一灰度条件下，避开无细胞的区域，每张切片选择5个不同的视野，用鼠标按细胞的形态画出细胞轮廓