Src、Fyn激酶对脑缺血-再灌注大鼠海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响.docVIP

　　Src、Fyn激酶对脑缺血/再灌注大鼠海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响 ：孙亚峰 裴冬生 张光毅 【摘要】 目的 观察脑缺血再灌注后海马Src家族酪氨酸蛋白激酶（Src family of protein tyrosine kinase, Src PTKs）成员Src、Fyn激酶对NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR, NR)NR2A亚基磷酸化水平的影响。方法 采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻断（four-vessel occlusion, 4-VO）大鼠全脑缺血模型，缺血前连续3天脑室注射Src、Fyn反义寡核苷酸（antisense oligode oxynucletides，AS-ODNs）及错义寡核苷酸组（missense oligodeoxynucletides，MS ODNs）后缺血15 min，用免疫沉淀和免疫印迹法检测NR2A亚基酪氨酸磷酸化水平的变化。结果 Fyn反义寡核苷酸使脑缺血再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平下降，而Src反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平影响更加明显。结论 脑缺血/再灌注过程中NMDA受体NR2A亚基的磷酸化主要是由Src激酶介导的。 【关键词】 Src；Fyn；NR2A；反义寡核苷酸；脑缺血 Abstract: Objective To investigate ia folloin) brain ischemia ia. DA receptor subunit NR2A during cerebral ischemia folloarily mediated by kinase Scr. Key ia 近年来，最受人们关注的缺血性脑损伤机制是兴奋性氨基酸（excitatory amino acid, EAA）的神经毒性作用及神经元内钙超载触发的级联反应［1］，其中NMDA受体（NR）的NR2亚基在缺血性脑损伤中起着非常重要的作用，在缺血/再灌注（ischemia/ reperfusion，I/R）过程中其蛋白表达、磷酸化水平均有改变。对NR2亚基有磷酸化调节作用的是Src家族酪氨酸蛋白激酶（Src family of protein tyrosine kinase, Src PTKs），这是一类膜结合的非受体酪氨酸蛋白激酶；现已知Src家族成员中Src、Fyn、Yes、Lyn、Lck在中枢神经系统中均有表达。本实验采用四动脉阻断（4-VO）大鼠全脑缺血模型，观察Src家族成员中Src、Fyn激酶对海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物 成年雄性SD大鼠,体重230～250 g，中国科学院上海实验动物中心提供(Ⅱ级,证书号005)。 1.1.2 药物 Src、Fyn反义、错义寡核苷酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，硫代磷酸修饰。Src蛋白的反义寡核苷酸（Src As-ODNs）序列是:①5′ATG GGT AGC AAC AAG AGC AAG CC 3′；②5′CAC AAG CGA CGG TGA GAA GCT AA 3′。Fyn蛋白的反义寡核苷酸（Fyn As-ODNs）序列是:①5′CGT CAG TTT CGC TGC TTC TTT 3′；②5′CGT TGT CAA GCT TGC GGA TTT 3′；③5′ TCC AGG TAC CCA TCC ATA CTT 3′。临用前混合溶于Tris-EDTA缓冲液（10 mmol/L Tris-Hcl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）。Src蛋白的错义寡核苷酸（Src Ms-ODNs）序列是：5′ACA GAG CAC CAG TGA GTA AGC AG3′，Fyn蛋白的错义寡核苷酸（Fyn Ms-ODNs）序列是：CTC GAG TCA CAC CTC AAT TCT3′。 1.2 方法 1.2.1 四动脉阻断全脑缺血模型 按Pulsinelli［2］法进行。水合氯醛麻醉大鼠，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后用电凝针电凝双侧椎动脉。12 h后,在大鼠清醒状态下，游离出双侧颈总动脉，用动脉夹阻断血流，缺血15 min，在缺血时大鼠肛温维持在36.5～37.5℃。随机分组：①Sham组，手术不缺血；②I/R 6 h组；③溶剂对照组（saline），脑室注射相同剂量的生理盐水；④I/R 6 h+Src As-ODNs组；⑤I/R 6 h+Fyn As-ODNs组；⑥I/R 6 h+Src Ms-ODNs组。⑦I/R 6 h+Fyn Ms-ODNs组。每只8只大鼠。缺血前3天经脑室注射给药，注射第3天缺血。