YB1表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响.docVIP

　　YB1表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响 ：杨靖 许文林 李娟 弓晋灵 吴晓君 陈巧云 王法春 【摘要】 　　目的： 观察Y盒结合蛋白1（YB1）对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。方法： 通过脂质体介导的方法将YB1 shRNA重组载体转染入人类乳腺癌MCF7细胞，经G418筛选及克隆化培养后获得稳定转染株。运用RTPCR和蛋白质印迹方法检测MCF7细胞中YB1 mRNA和YB1蛋白的表达水平，运用划痕实验和Transigration capability of breast cancer cells.Methods： The rebinant eukaryotic expression plasmid including YB1 shRNA ine mediation and the cell line RNA and protein ined by RTPCR and MP2 protein ography. Results: The expression of YB1 in the cells transfected uch less than the cells transfected fragment and the control group. The mobility, invasiveness, migration capability and the expression of MMP2 as uch loigration capability of cells， and decrease the expression of MMP2 and the activity of MMP2 protein. 　［Key igration capability; MMP2 　　Y盒结合蛋白1（Ybox binding protein1，YB1）是Y盒蛋白家族成员之一，广泛分布于原核与真核生物，它参与多种生命活动过程，研究发现YB1与人类恶性肿瘤关系非常密切，在部分类型的肿瘤中表达量偏高，已证实YB1异常表达的肿瘤类型有前列腺癌、乳腺癌、肺癌等［1］，尤其在前列腺癌［2］和乳腺癌［3］中，YB1的表达量随病情恶化而增加，这些证据表明YB1与这些恶性肿瘤的发生、 发展 呈高度相关性。目前的研究结果表明YB1与肿瘤细胞的增殖和耐药及相关基因的转录调节有关，而关于YB1与肿瘤细胞的迁移和侵袭的关系研究相对较少。本研究运用基因沉默的方法将YB1 shRNA质粒转染入乳腺癌MCF7细胞中，观察其对MCF7细胞中YB1的表达以及细胞迁移和侵袭能力的影响，从而为乳腺癌基因靶向 治疗 提供依据。 　 　1 材料和方法 　　1.1 研究对象 　　人乳腺癌细胞株MCF7，购自南京凯基生物有限公司。培养于RPMI1640完全培养基，其中含10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，置于37℃，5%CO2恒温保湿培养箱内培养。 　　1.2 试剂和仪器 　　胎牛血清和小牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640培养液、G418、脂质体LIPOFECTAMIM2000，TRIzol Reagent（Invitrogen公司），MMLV逆转录酶，TaqDNA聚合酶及其缓冲体系，dNTP，RNA逆转录酶及随机引物（Fermnent公司），靶向YB1基因的shRNA质粒pGenesIL1.1/YBX11，pGenesIL1.1/YBX12，pGenesIL1.1/YBX13和对照质粒pGenesIL1.1/HK（本实验室保存）。YB1和MMP2及GAPDH基因的引物由上海生物工程公司保存。兔抗人GAPDH多克隆抗体及兔抗人MMP2多克隆抗体购自武汉博士德生物公司，兔抗人YB1多克隆抗体购自ABCAM公司。明胶酶谱法电泳分析试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。 　　1.3 基因转染及阳性细胞克隆的筛选 　　采用LIPOFECTAMIM2000脂质体转染法转染，操作流程按照说明书进行。转染48 h后换含G418 400 μg/L的完全培养液抗性筛选2周，未转染组MCF7细胞全部死亡，转染pGenesIL1.1/YBX11，pGenesIL1.1/YBX12，pGenesIL1.1/YBX13和对照质粒pGenesIL1.1/HK组的细胞均有抗性细胞生长，分别命名为MCF7/Y1，MCF7/Y2，MCF7/Y3，MCF7/HK。 　　1.4 YB1，MMP2基因的检测 　　采取半定量反转录聚合酶链反应（RTPCR）法。应用TRIzol体系提取RNA，反转录合成cDNA，-20℃保存。YB1