丹芪合剂和依那普利对糖尿病大鼠肾小管HGF和SnoN表达的影响.docVIP

　　丹芪合剂和依那普利对糖尿病大鼠肾小管HGF和SnoN表达的影响 ：李晓颖，郭兵，刘瑞霞，肖瑛，石明隽，王圆圆，皮明婧，张国忠 【摘要】 　　目的观察丹芪合剂和依那普利对糖尿病大鼠肾小管HGF和SnoN表达的影响。方法SD大鼠随机分为4组：正常对照组（N组），糖尿病组（D组），中药丹芪合剂 治疗 组（Y组），依那普利治疗组（E组）。采用链脲佐菌素尾静脉注射（55 mg/kg）的方法复制糖尿病模型。生化方法测血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、胆固醇，并 计算 肾脏指数。HE染色光镜检查肾组织形态学变化。免疫组化观察大鼠肾脏SnoN、HGF、TGF-β1、FN蛋白表达情况，）最常见的严重并发症之一 ，发病机制复杂，治疗也很困难，最终 发展 为终末期肾衰竭（ESRD），严重威胁人类健康。转化生长因子β1（transforming groads通路发挥作用。近年来研究发现［1］，转录共抑制因子SnoN是TGF-β1/Smad信号通路重要的负性调节因子，它可与Smads蛋白相互作用，抑制TGF-β1靶基因的活化，从而调控TGF-β1的生物效应。我们近期的研究表明［2］，DN时SnoN蛋白的表达明显降低，对TGF-β1/Smad信号通路的负调控作用减弱，从而促进DN的发生发展。据报道［3］，肝细胞生长因子（hepatocyte groad信号通路，减缓肾纤维化进展。我们以往的研究表明［4，5］，丹芪合剂和依那普利对肾纤维化有一定的治疗作用，但其作用机制未充分阐明。本研究旨在观察丹芪合剂和依那普利是否通过调节肾小管HGF、SnoN的表达而起到改善DN的作用。 　 　1 材料与仪器 　　1.1 药物和试剂链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自Sigma公司；血糖、肌酐、甘油三酯、胆固醇检测试剂盒购自迈克公司，尿蛋白检测试剂盒购自南京建成公司；兔抗鼠SnoN多克隆抗体购自SantaCruy公司；兔抗鼠HGF、TGF-β1和FN多克隆抗体，β-acting单克隆抗体，免疫组化SABC试剂盒，辣根过氧化物酶标记的二抗，ECM显色试剂盒均购自武汉bostor公司，DAB显色剂，SP试剂盒购自北京中杉金桥公司；m an滤纸购于美国milli-pore公司；依那普利，扬子江制药厂生产；丹芪合剂为丹参、黄芪、生地黄等中药的自制提取液。 　　1.2 器材美国强生血糖仪；高速低温离心机（Beckman公司）；核酸蛋白分析仪（Amersham公司）；电泳系统及电转移装置（Amersham公司）；凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）。 　　 2 方法 　　2.1 动物及分组雄性SD大鼠48只，体质量180～220 g，购于上海实验动物中心。随机分为4组，每组12只：正常对照组(N组)、糖尿病组(D组)、糖尿病丹芪合剂治疗组(Y组)和糖尿病依那普利组(E组)。用0.1 mmol/L，pH 4.0 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将链脲佐菌素(STZ)配成5%的溶液，D组、Y组、E组按55mg/kg的剂量单次尾静脉注射，N组大鼠尾静脉注射0.2 ml等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。48h后尾静脉采血测量空腹血糖值，大于或等于16.7者为糖尿病大鼠模型。除N组外所有动物全部成模。各组大鼠均喂食颗粒饲料，自由饮自来水，成模第2日起，Y组大鼠给予丹芪合剂灌胃1.8 g/（kg·d），E组大鼠依那普利灌胃2 mg/（kg·d），N组和D组大鼠1.5 ml自来水灌胃。 　　2.2 血、尿及肾脏标本的采集大鼠饲养12周后处死，处死前称体质量，代谢笼收集24 h尿量并计量，-20℃保存。股动脉取血，离心分离血清，-20℃保存。空腹8 h后处死动物，生理盐水充分灌洗肾脏，滤纸吸干后称重，一侧肾固定于4%多聚甲醛中供石蜡切片用，另一侧肾脏于-80℃保存供 creatinine, SCr)；超微量酶法检测总胆固醇(cholesterol，Ch)；GPO-PAP法检测甘油三酯(triglyceride, TC)。 　　2.4 肾组织形态学观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，HE染色后光镜观察肾组织形态学变化。 　　2.5 免疫组化法观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，用免疫组化SP法检测各组大鼠肾皮质中SnoN和HGF表达，一抗浓度分别为1∶100、1∶200，用SABC法检测各组大鼠肾皮质中TGF-β1和FN，一抗浓度为1∶100、1∶50，阴性对照用PBS代替一抗。DAB显色，苏木素复染。SnoN、HGF、TGF-β1在高倍镜（400×）下随机计数10个不重复视野，对染成棕黄色的肾小管数进行统计，取均值；FN在显微镜测微尺（0.5网形目镜尺）下随机计数十字交叉点与FN阳性染色表达重合的点数，计数10个视野（400×），取均值。 　　2.6 g，蛋白裂解液提取总