健脾化瘀方对人肝癌细胞ras-MAPK通路的影响.docVIP

　　健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/MAPK通路的影响 【关键词】 健脾化瘀方；RTPCR；ras/MAPK 　　【Abstract】Objective To study the effect of Jianpi Huayu Recipe on ras/MAPK signaling pathan hepatoma cell.Methods The gene expression ethod and gel electrophoresis analysis system.Results ERK,sos1,cfos gene expression an hepatoma cell and induce the apoptosis by inhibiting the expression of gene ERK,sos1,cfos of the ras/MAPK signaling pathl蒸馏水加热回流提取2次，每次1小时，合并提取的药液，微波真空干燥。配制成相当于生药浓度1 g/ml的药液灭菌备用，实验时配制为6 mg/ml浓度。 　　2.实验方法 　　(1)细胞准备：取处于对数生长期的人肝癌细胞SMMC7721，以5×105个/ml密度接种于直径6 cm的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h以使细胞贴壁，弃原培养液，加入健脾化瘀方终浓度为6 mg/ml的含10%小牛血清的DMEM培养液，继续培养48 h后，用PBS洗2次，每皿加1 ml trizol，反复吹打后收集细胞于EP管中。立即使用或-70℃保存待用。以对数生长期肝癌细胞SMMC7721为对照。 　　(2)RNA制备：每皿1 ml Trizol提取的细胞后，每ml加入200 μl氯仿，静置10 min后离心，取上清移至新EP管，加入等体积异丙醇，室温放置 10 min后离心，弃上清沉淀即总RNA。每管加入1 ml 75%乙醇（用DEPC处理过的水配制），离心5 min倒掉乙醇，室温晾干，加入20 μl DEPC处理水，吹打混匀，随即使用或-70℃保存待用。 　　(3)RNA质量鉴定：取2 μl RNA加入500 μl DEPC水中，在紫外分光光度仪上测定RNA样品在260 nm和280 nm处的吸光度(OD)值。OD260与OD280比值在1.8～2.0之间，表明无RNA降解。2%琼脂糖凝胶40～60 V预电泳10　min后，60 V电压电泳至溴酚蓝迁移到凝胶的3/4处;紫外灯下观察18 S和28 S带情况，可见28 S的宽度及亮度约是18 S的两倍，边缘清晰，表明完整性较好，可用于RTPCR。 　　(4)逆转录：采用TaKaRa逆转录试剂盒，按照说明书操作。37℃孵育15 min，85℃ 5 s灭活反转录酶，4℃ 结束，取出低温保存。 　　(5)聚合酶链式反应：采用TaKaRa PCR试剂盒，按照说明书操作。扩增条件：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环32次（SOS1：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环32次）。RTPCR引物设计见表1。表1 RTPCR实验引物设计（略） 　　(6)电泳凝胶分析：2%琼脂糖凝胶电泳，电压55 V，时间35 min。采用Tanon GIS2010凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶进行吸光度扫描，测量条带的灰度强弱。结果以目的基因和βactin的积分吸光度比值表示。以上实验均重复3次。 　　3.统计学分析 　　统计分析采用SPSS13.0软件包进行数据处理，所有数据均用均数±标准差（-±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。 　 　结果 　　健脾化瘀方对人肝癌细胞株SMMC7721作用48 h后，通过RTPCR和凝胶电泳，利用凝胶电泳成像分析系统扫描条带的积分吸光度值，并与同管扩增的βactin条带积分吸光度做比值，代表基因表达的量。实验结果为：ERK、SOS1、cfos基因表达较对照组低，ERK、SOS1各浓度组与对照组比较差异有显著的统计学意义（P＜0.01），cfos高浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；见表2。MEK、Raf、Ras、Grb2基因的表达与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。凝胶电泳图见图1。表2 健脾化瘀方作用肝癌细胞后相关基因产物凝胶电泳条带吸光度比值（略） 　 　讨论 　　MAPK经典的信号转导过程包括：细胞外信号→酪氨酸蛋白激酶受体（receptor protein tyrosine kinase，RPTK/RTK）→含有SH2结构域（Scr homology 2 domain）的接头蛋白（如GRB2）→鸟嘌呤核苷酸释放因子（如s