地塞米松对哮喘小鼠气道炎症反应和STAT6表达的影响.docVIP

　　地塞米松对哮喘小鼠气道炎症反应和STAT6表达的影响 【摘要】 目的： 研究地塞米松对支气管哮喘小鼠急性气道炎症反应的作用及对信号转导子和转录激活子6(STAT6)表达的影响。方法： 用免疫组织化学法检测给予地塞米松后哮喘小鼠肺组织中STAT6的表达。结果： 哮喘组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、嗜酸粒细胞(EOS)绝对值显著高于对照组(Plt;0.01),上述炎症细胞计数地塞米松组比哮喘组明显减少(Plt;0.01) 。HE染色示地塞米松组小鼠气道炎症反应程度较哮喘组减轻。STAT6在气道上皮细胞表达,哮喘组气道上皮细胞中STAT6 表达较对照组增加,地塞米松组STAT6表达与哮喘组比较明显减少,较对照组增加。支气管上皮细胞STAT6蛋白与BALF中的EOS绝对值呈显著正相关。结论： 地塞米松可在一定程度上减轻哮喘小鼠的气道炎症反应,作用机制可能是通过下调肺脏组织中STAT6蛋白的过度表达,从而抑制依赖于STAT6/IL4通路的急性气道炎症反应。 【关键词】 支气管哮喘;信号转导子和转录激活因子6;Th1/Th2;地塞米松;小鼠 糖皮质激素在 治疗 哮喘方面的一线作用已勿庸置疑, 其可以抑制多种炎症细胞的活化和炎症因子的生成及释放,降低血管通透性,提高β2受体的敏感性,对于哮喘的急性炎症及慢性气道重塑都有肯定的疗效[12]。本研究通过观察地塞米松对哮喘小鼠气道炎症反应的影响及信号转导子和转录激活子6(STAT6)在气道上皮细胞的表达情况,探讨地塞米松治疗哮喘的分子机制,为临床治疗提供理论依据。 　 　1 材料与方法 1.1 材料 　　1.1.1 实验动物及分组 24只清洁级BALB/c小鼠,雄性,6周龄,体重18～20g, 由扬州大学实验动物中心提供,许可证号为SCXK(苏20070001)。采用随机数字法将小鼠随机分为哮喘组、地塞米松组和对照组3组,每组8只。哮喘组、地塞米松组分别于第0、7天腹腔注射0.2ml致敏液[含卵白蛋白(OVA)100μg加氢氧化铝400μg的生理盐水溶液],14d后将小鼠置入自制密闭箱(30cm×45cm×54cm)内,用10g·L-1OVA溶液超声雾化激发哮喘,30min·d-1,连续7d。地塞米松组每次激发前半小时予地塞米松2mg·kg-1腹腔注射;对照组全部以生理盐水代替。 　　1.1.2 标本采集 3组小鼠在OVA最后1次激发后24h眼球摘除采血,颈椎脱臼处死小鼠,打开胸腔,结扎左肺门根部,取出左肺投入10%中性福尔马林溶液中固定。颈前暴露气管,做横形切口插入静脉留置针,进行右侧支气管肺泡灌洗。 　　1.1.3 主要仪器和试剂 勃林格殷格翰超声雾化器、台式离心机购自上海安亭 科学 仪器厂,自制密闭箱、OVA(Grade Ⅱ)、氢氧化铝凝胶购自美国Sigma公司。地塞米松磷酸钠注射液购自浙江仙居制药股份有限公司,兔抗小鼠STAT6多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 肺泡灌洗液(BALF)的留取 在环状软骨上用血管钳固定气管,其下作横行切口,置入连接注射器的硅胶管,分3次缓慢注入生理盐水,每次注入量为0.3ml,每次灌洗后立即回收置于离心管中,计量,回收率约80%以上,于-4℃储存,2h内作细胞分离。 　　1.2.2 BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞(EOS)计数 采用离心机对BALF液以1500r·min-1离心10min,细胞沉淀用0.5mlPBS液重悬,取0.1ml于血细胞计数台测定细胞总数,sa染色进行细胞分类计数,EOS绝对值计数使用伊红染液染色。 　　1.2.3 HE染色 取左肺以中性福尔马林固定,石蜡包埋后切片,行HE染色。每只各做5张切片,观察支气管及周围的炎症细胞浸润情况。 　　1.2.4 免疫组织化学法检测肺组织STAT6蛋白表达 肺组织STAT6表达检测步骤按SP使用说明书进行。一抗:STAT6兔抗小鼠多克隆抗体,稀释度为1∶400;二抗及检测试剂盒为SP工作液,3,3二氨基苯联胺(DAB)显色,苏木精复染,阳性细胞核着色呈棕黄色。本实验STAT6蛋白阳性表达主要集中于各级支气管(细支气管、终末细支气管和呼吸性细支气管)的上皮细胞。显微镜下观察组织着色情况,细胞质清晰、染色呈棕色为阳性,采用图像分析软件(ImagePro plus 4.5)对STAT6阳性部位进行原位定量检测,每张切片随机选用5个视野(10×40),自动选取阳性部位并 计算 相对IOD值。 　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件,对样本先行正态性和方差齐性检验,条件满足时,用单因素方差分析(One l-1 　　组 别n细胞总数EOS计数对照组87.96±0.620.08±0.061) 地塞米松组89.