拟南芥VKOR基因缺损对抗逆基因AnnAT1表达影响.docVIP

　　拟南芥VKOR基因缺损对抗逆基因AnnAT1表达影响 1 前言 1.1盐胁迫 盐胁迫是由渗透胁迫和离子胁迫组成的，在盐胁迫条件下，植物的外部形态和内环境的生理特性都发生了一系列的变化，盐胁迫伤害引起的变化有一些是植物对逆境条件的消极反应，有些变化引起了植物对逆境的积极反应，有利于对逆境环境条件的适应（许祥明等，2000）。盐胁迫是指土壤中可溶性盐类含量过高而对植物的正常生长与发育所造成的不利影响（Parida and Das, 2005）。盐土、盐化土、碱土以及碱化土壤统称为盐碱土，又被称为盐渍土壤。盐化土壤一般含有多种钠盐，Na+盐分对植物个体形态发育具有显著的影响，其表现就是盐胁迫抑制了植物组织和器官的生长，加速了发育进程，缩短了营养生长期和开花期，使禾本科植物的分蘖数和籽粒数减少等。植物长时间的盐胁迫会造成叶片的面积变小（Munnset al. 1988），这可能是由于盐分降低了细胞的分裂或是降低了细胞延伸的速率。盐胁迫抑制在悬浮培养细胞的细胞分裂的实验现象极为明显，Bernstain 等以高粱叶片为材料进行了盐胁迫处理，观测到叶片的生长区比正常条件下变小是这种土壤最主要的一种有害离子，氯化钠和硫酸钠含量较多的土壤被称为盐土；含较多碳酸钠和碳酸氢钠的土壤，被称为碱土。土壤中往往会同时存在上述两种土壤，因此称其为盐碱土（张其德，1999）。盐胁迫主要包括渗透胁迫和离子胁迫还有它引起的次级胁迫（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 1997），这些胁迫严重破坏了植物体内细胞的植株水平上的内环境水分子和离子稳态平衡，导致了植物细胞分子破裂，植株生长减缓乃至死亡（Green et al.,1998）。一部分研究者认为这很可能与细胞壁的硬化（指不可逆伸展能力，即伸展性）有密切关系。在干旱条件下细胞壁的硬化有效地缩小了植物叶面积，因而也就显著地阻止了植株的蒸腾失水，增强了植株的生存能力。干旱胁迫下植物的生物量分配也发生明显变化。水分缺失条件下植物生物量向根部的分配增加，功能根变多，并且长度也会增加。不同品种的植物耐旱性也不同，在干旱胁迫下的反应也不同，抗旱的杨树无性系在干旱的初期阶段可以将更多的物质优先向根和茎运输，而对干旱敏感的植株无性系在水分缺失的条件下缺乏这种分配的可塑性（Timothy et a1., 1998）。调整气孔开合的程度来阻止植物体内水分的快速散失以及维持一定的光合作用是植物对水分缺失胁迫的初始反应。气孔反应有 2 种方式：一种叫第一线防御，又被称为预警系统，它能按照空气湿度的大小作出直接的反应。当空气湿度降低时，保卫细胞和附近的表皮细胞直接蒸发水分，引起气孔迅速关闭，此时叶子等其他部位并没有水分亏缺的状况，所以它可以防止整片叶子发生水分亏缺，降低了干旱对植物产生的伤害。另一种叫第二线防御，它是针对叶子已经发生了水势变化的应对。当叶子水势降至一定程度时，引起气孔关闭，这样就会使水分散失量减少，同时也有助于叶子恢复本来的水势。等到叶子水势恢复成功，则气孔就会再次开放。 2 材料与方法 2.1 实验材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana, Col）的种子为本实验室保存；突变体材料购自Arabidopsis Biological Resource Center，为本实验室保存；培养条件，长日照为 16h光照/8h黑暗，22 C；短日照为 8h光照/16h黑暗，22 C。本研究所用的大肠杆菌菌株为 DHB4 和 BL21，由本实验室保存；原核表达载体 pET30a 为本实验室保存。EasyTaq DNA 聚合酶、 EasyPfu DNA 聚合酶从北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司购得；T4 DNA 连接酶、限制性内切酶 BamHI、XhoI 从大连 TaKaRa 公司购得。dNTP、DL2000 DNA Marker、DL2000 Plus DNA Marker、DL2000 Plus II DNAMarker 从北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司购得；低分子量蛋白 Marker 购于 TaKaRa 公司；质粒小量快速提取试剂盒从生工生物工程（上海）有限公司购得；IPTG 购于上海生物工程公司；HisTrap HP 蛋白纯化柱购自 GE公司；碘乙酰胺、考马斯亮蓝（G-250）为 Sigma 进口分装产品；小分子量标准蛋白、咪唑从普天公司购得；其他的药品和试剂如 NaCl、MgCl2、CaCl2、NaOH均为国产分析纯试剂。 2.2 主要试剂的配制 （1）1mol/LTris-HCl（pH8.0）：称取 12.11g Tris，加入约 80mL 去离子水，用浓盐酸调节 pH，待溶液冷却至室温后调准 pH 至 8.0，