腺病毒介导的BMP2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响.docVIP

　　腺病毒介导的BMP2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响 ：崔少千,范广宇,李建军,周凤华,于洪德,张磊,李雷,王欢 【摘要】 目的： 用骨形态发生蛋白2(BMP2)腺病毒表达载体(AdBMP2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响。方法： 用AdBMP2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP2的表达。流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响。酶标法检测ALP活性；免疫荧光检测骨钙素（O）、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响。结果： BMP2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP2蛋白阳性表达。流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异。ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质。结论： 在腺病毒载体介导下BMP2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化。 【关键词】 腺病毒；骨形态发生蛋白2；骨髓基质干细胞；基因 治疗 BMP2是最主要的骨形成调控因子之一,在体内和体外能够诱导干细胞分化和骨形成。骨组织工程中应用缓释技术将BMP2加入载体的方法虽然取得了一些成果,但从理论到技术均有尚不完善之处。本实验采用体外基因治疗策略,将携带BMP2基因的重组缺陷型腺病毒表达载体（AdBMP2）转染骨髓基质干细胞(BMSCs),检测BMP2基因表达，观察基因转染对BMSCs增殖及成骨分化的影响,探讨其作为内源性BMP2的“生物发生器”以及骨组织工程种子细胞的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 腺病毒载体及细胞 AdBMP2、携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（AdLacz）和人胚肾293细胞,由 中国 医科大学附属盛京 医院 骨科李建军博士提供。通过感染293 细胞扩增病毒,测定AdBMP2滴度为2×1010 PFU·ml-1。 1.1.2 实验动物 新西兰大耳白兔,雌雄不限,体质量2.0～2.5kg,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供,许可证号：SCXK（辽2003-0013）。 1.1.3 主要试剂 DMEM细胞培养基（北京海克隆生物制品有限公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品有限公司）；BMP2单克隆抗体、原位杂交检测试剂盒和免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；骨钙素、Ⅰ型胶原单克隆抗体（Santa Crus公司）；二抗FITC标记IgG（北京中杉金桥）；Xgal（大连宝生物公司）;碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。 1.1.4 主要仪器 垂直电泳仪（BioRad）；转印电泳仪（Amersham公司）；可调温摇床（哈尔滨东联公司）；台式低温离心机（Eppendorf公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（芬兰雷勃集团MK3）；荧光显微镜（日本 Olympus）。 1.2 方法 1.2.1 兔骨髓基质干细胞培养及转染 用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,2周左右贴壁细胞基本长满单层,即得到原代培养细胞。按1∶3或1∶4比例分瓶传代培养。BMSCs（P2）长至基本融合时,更换成含2%FBS的DMEM培养液,细胞计数,根据病毒滴度按感染倍数（MOI）为100（即1个细胞用100个病毒颗粒感染）加入相应体积的AdBMP2,过夜。次日换成含10%FBS的DMEM正常培养液培养2 d。同等条件下AdLacz转染细胞（MOI=100）,Xgal免疫染色检测转染效率。实验组：AdBMP2转染；实验对照组：AdLacz转染；空白对照组：未转染。 1.2.2 原位杂交、免疫细胞化学染色检测细胞内BMP2基因表达 取各组细胞,以1×105 ml-1的密度接种于多聚L赖氨酸处理过的盖玻片上,待贴壁细胞密度达到50%左右时取出盖玻片,PBS漂洗3次,4％多聚甲醛固定。分别按BMP2原位杂交、免疫组化试剂盒操作步骤进行操作,DAB显色,苏木素复染,透明,封片,光镜观察。 1.2.3 P2蛋白 各组细胞换无血清培养液孵育12h,收集培养液20ml,冻干机冻干后加入50μl上样缓冲液。取10μl样品,煮沸5min,离心5min,上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%SDSPAGE）分离。SDSPAGE电泳在恒压条件下进行,浓缩胶中为120V,分离胶中为160V。常规转膜,封闭,然后按膜面积 计算 一抗用量（0.1ml·cm-2）,使用Tl+二氨基联苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml,最后加入H2O2至0.14%）,室