苦参碱对脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响.docVIP

　　苦参碱对脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响 【关键词】 苦参碱；一氧化氮合酶活性；内皮细胞；一氧化氮 　　Abstract：Objective To investigate effects of constant matrine on nitric oxide(NO)production and nitric oxide synthase(NOS)activity in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). Methods The third passage of cultured HUVEC atrine group((50μg/L，100μg/L，200μg/L，500μg/L，1000μg/L)Samples ined using Griess reagent，and NOS activity of hUVEC RNA ined by reversetranscription PCR(RTPCR).Semiquantitative analysis of the RTPCR products ade inator. Results NO levels、NOS activity、the level of mRNA expression in matrine group RNA expression atrine dosage reaches a certain level. 　　Key mol/L N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，DAB显色试剂盒为北京中山生物工程公司产品，Trizo为Invitrogen公司产品，PCR试剂盒为Takara公司产品。CMIAS多功能真彩图像分析仪为北京航空航天大学产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 HUVEC的培养和鉴定 　　取新鲜婴儿脐带，D-Hanks液冲洗，注入0.1mg/L胶原酶，置37℃ D-Hanks液中消化15min，收集酶液，1000r/min 离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬，以2×105/mL的密度接种于培养瓶，于37℃、饱和湿度、50mL/L CO2条件培养，24h后换液。待细胞长满瓶后，1g/L胰酶消化、传代3～5代细胞用于实验。 　　1.2.2 实验分组及处理 取生长状况良好的第3代细胞，以1×107个细胞数接种于96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，每组5个复孔，并同时进行细胞爬片。细胞在接近融合生长时，换用无血清培养基培养24h。实验随机分为6组：对照组不予苦参碱干预；苦参碱组在培养基中加入苦参碱，剂量分别为50、100、200、500、1000μg/L。各组细胞接种数目及培养条件一致，均于24h后收集培养液和细胞标本。 　　1.2.3 一氧化氮浓度测定 用Griess法测定培养基中一氧化氮的稳定代谢产物亚硝酸盐(NO2-)浓度。测定方法按照NO试剂盒说明书操作。收集的培养液与Griess试剂［1%对氨基苯磺酰胺，0.1%N(1萘基)乙二胺，2.5 %磷酸］反应，721分光光度计检测，从亚硝酸钠标准曲线上换算NO值，以fmol/d 表示。 　　1.2.4 一氧化氮合酶(NOS)活性测定 按照NOS试剂盒说明书操作。NOS活性测定原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反应形成NO，NO与亲合性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定吸光度，以此代表细胞NOS活性。细胞破碎采用超声波法裂解，蛋白定量采用Lool NO为一个活性单位。NOS活性=(测定管吸光度-空白管吸光度)÷呈色物纳摩尔消光系数×(反应液总体积÷取液量)×1/(比色光径×时间)÷样品蛋白质含量，其中呈色物纳摩尔消光系数为38.3×10-6。 　　1.2.5 RNA的提取及筛选 以Trizol试剂提取细胞总RNA。经0.9%琼脂糖凝胶电泳(50mV，1h)确定提取RNA的质量。用核酸定量仪测定样品在260nm处的吸光度(1A=40μg/mL)，确定RNA的浓度。所用RNA的A260/A280应控制在1.80以上。 　　1.2.6 RT-PCR 取1μL RNA(1g/L)作cDNA模板，以oligodT为引物，按试剂盒操作顺序依次加样，总反应体积为20μL，反应混合物于42 ℃孵育45 min，目的基因iNOS引物序列及内参物β-actin引物序列参照 文献 ［5］设计。iNOS引物序列为：上游5′-CCAGCTAGCCAAAGTCACCAT-3′；下游5′-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3′；扩增产物为353bp.β-actin(5′)，5′-caccacaccttctacaatgagc-3′；β-act