达肝素钠对A549细胞生长状态及细胞周期的影响.docVIP

　　达肝素钠对A549细胞生长状态及细胞周期的影响 ：陈克芳 陈芳兰 黄龙杰 【摘要】 目的 研究达肝素钠对体外生长的肺腺癌A549细胞活性及细胞周期的影响。方法 用6种不同浓度(0、2、10、50、100和500 IU/ml)的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT方法在4个时间点(6、12、24和36 h)检测细胞活性;将经过24 h普通培养的A549细胞继续在含有50 IU/ml达肝素钠的培养液中培育，以正常培育的细胞作为对照组，将两组细胞24 h后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期。结果 达肝素钠降低A549细胞活性，这种作用表现出时间依赖性和浓度依赖性;达肝素钠主要抑制细胞在G1期。结论 达肝素钠对A549细胞活性的降低与对细胞周期的抑制作用有关。 【关键词】 低分子量肝素;达肝素钠;肺腺癌;细胞周期 　肝素及其衍生物的抗细胞增殖作用，目前在平滑肌上进行的研究较多。Guyton等〔1〕报道，不论在体内还是在体外，肝素都能降低平滑肌细胞(SMC)的有丝分裂。其他部位的SMC，如气道及肠道、子宫肌层及子宫肌瘤的生长也能被肝素抑制〔2〕。也有在内皮细胞上进行的关于肝素的抗增殖作用研究，如Khorana等〔3〕报道肝素抗微血管内皮细胞(MVECs)和奇静脉内皮细胞的作用。关于未分级肝素(UFH)或低分子肝素(LMI 1640培养基(Gibco);达肝素钠(Fragmin)。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 MTT法检测细胞活性 将培养的A549细胞用胰酶消化，调整细胞浓度,培养24 h。弃去培养基，加入含有所需浓度达肝素钠的RPMI 1640培养基，继续培养。实验结束前4 h,加入MTT，继续培养。4 h后弃去培养基，加入DMSO，避光振荡10 min。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值(OD)。 　　1.2.2 PI染色法检测细胞周期分布 将培养的A549细胞用0.25%的胰酶消化，传代到6孔板的各孔中，培养24 h。弃去培养基，加入含有所需浓度达肝素钠的RPMI 1640培养基，继续培养。在设定的时间点按组收集细胞。收集的细胞以预冷PBS洗涤2次。离心5 min，弃上清。 加入含0.5% PI和0.01%RNase染液，重悬细胞，室温避光反应30 min。1 h内流式细胞仪检测，在488 nm激发波长下测定DNA含量，分析细胞周期的分布情况。 　　1.3 统计学分析 数据以x±s表示，SPSS11.0统计软件分析,两组间比较用t检验。 　 　2 结 果 　　2.1 达肝素钠对A549细胞细胞活性的影响 用6种不同浓度(0、2、10、50、100和500 IU/ml)的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT方法在4个时间点(6、12、24和36 h)检测细胞活性。达肝素钠能降低A549细胞活性，而且这种作用表现出时间和浓度依赖性。在不含达肝素钠的培养基中培育的细胞，其12 h和24 h的细胞活性基本一致，但24 h的细胞活性明显下降，这种下降是由培养基营养成分的耗竭所致，故24 h以前的细胞活性值较能准确反应药物对细胞的影响。该数据还显示，用高浓度的达肝素钠(100和500 IU/ml)培养细胞24 h后，A549细胞活性大部分被抑制，但这种抑制可能与药物的毒性作用有关。 50 IU/ml达肝素钠在干预细胞生长24 h后能抑制大约50%的细胞活性。为避免培养基成分的变化和药物毒性作用对实验结果的干扰，在随后的试验中，选择50 IU/ml达肝素钠为干预浓度，测定干预24 h后的各项指标。见图1。图1 达肝素钠对肺腺癌A549细胞细胞活性的影响 　　2.2 达肝素钠对A549细胞细胞周期的影响 为观察达肝素钠对A549细胞周期进展的影响，将经过24 h普通培养的A549细胞继续在含有50 IU/ml达肝素钠的培养液中培育，以正常培育的细胞作为对照组，将两组细胞24 h后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期的分布。流式细胞分析显示达肝素钠抑制细胞周期的进展。与对照组相比，实验组细胞在G1期比率显著增加〔(75.7±2.1)%、(54.8±1.9)%;Plt;0.05〕，在S期比率明显降低〔(11.3 ±1.96)%、(32.1±1.5)%;Plt;0.05〕。处于G2/M期的细胞比率虽有增加，但这种差异与对照组比较没有统计学意义〔(9.2±1.1)%、(11.3±2.1)%;Pgt;0.05〕。 　 　3 讨 论 　　临床观察发现，以UFH和LMOUS(the fragmin advanced malignancy oute study)表明，皮下注射LMALT(malignancy and loolecularOUS类似〔6〕。研究还发现，LMC对肝素的