重组大鼠41BBL对树突状细胞免疫学功能的影响.docVIP

　　重组大鼠41BBL对树突状细胞免疫学功能的影响 【关键词】 大鼠41BBL 树突状细胞 免疫功能 　　41BBL（CD137L） 为肿瘤坏死因子超家族中的成员, 在免疫系统中与41BB结合提供共刺激信号增强机体的免疫反应, 有望在感染性疾病、 肿瘤、 自身免疫性疾病等中发挥重要作用［1, 2］。最近体内外实验表明41BBL和41BB存在双向信号, 而且在人和小鼠不同细胞表现出相反的生物学功能［3］。人的41BBL基因尽管成功克隆了十多年, 但作为共刺激分子不能类似于其他抑癌基因等通过免疫缺陷动物进行体内实验, 而以大鼠制作的各种人类疾病模型非常成功, 尤其是各种肿瘤和移植模型。我们利用先前克隆的大鼠41BBL构建了重组质粒pIRES2EGFP41BBL, 并转染HepG2细胞获得稳定表达, 对重组大鼠41BBL影响树突状细胞免疫学特性进行了初步研究, 为进一步研究41BBL的生物学功能提供实验基础。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 SD大鼠(雌雄不拘, 体质量180～200 g, 10只)购于苏州大学医学院动物中心; pIRES2EGFP质粒由苏州大学第一 医院 传染科黄小平医生惠赠; pMDT1841BBL质粒由苏州大学生物技术研究所保存; T4 DNA连接酶、 限制性内切酶NheⅠ、 EcoRⅠ电泳上样缓冲液、 Taq、 pfu DNA多聚酶、 逆转录酶均购自大连TaKaRa 公司; 引物由上海生工生物工程公司合成; 重组基因由上海英骏公司测序; rrIL4 、 rrGMCSF、 PE标记的小鼠 CD80 mAb及 FITC标记的小鼠MHCⅡmAb均为美 国 Protech公司产品, 灭活新生小牛血清（FCS）、 DMEM 及RPMI1640培养基均为Gibco公司产品; IL6、 IL12 ELISA试剂盒由上海森雄公司提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 pIRES2EGFP41BBL的构建和鉴定 以pMDT1841BBL质粒为模版进行PCR, 产物胶回收后和真核表达质粒pIRES2EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切于37℃反应4 h, 电泳后胶回收。用T4 DNA连接酶于4℃过夜。随后以连接产物转化大肠杆菌 TOP10, 37℃ 16 h挑选阳性克隆, 增菌并提取重组质粒, 再以PCR、 双酶切鉴定, 最后重组大肠杆菌送上海英骏公司测序。 　　1.2.2 HepG2细胞的转染和稳定筛选 HepG2细胞转染按Lipofectamine2000说明书操作, 分成3组, 第 l组加入 pIRES2EGFP41BBL重组质粒, 第2组pIRES2EGFP空质粒, 第 3组为脂质体对照组, 转染细胞经G418筛选2月, 荧光显微镜观察EGFP的表达并收集细胞RTPCR检测。 　　1.2.3 大鼠DC细胞的分离培养 取健康SD大鼠, 断颈处死, 浸入750 mL/L乙醇中 5～10 min, 无菌手术取出股骨和胫骨, 尽量剥去肌肉组织, 用 PBS洗涤 3次, 剪去骨两端, 洗涤 2次, 用灭菌注射器抽取5 mL PBS, 将针头从两端插入骨髓腔, 反复冲洗出骨髓直至骨变白, 收入离心管中, 3 000 r/min离心20 min, 弃上清, 沉淀细胞用 PBS重悬, 混匀, 缓慢加至已有淋巴细胞分离液的离心管内, 形成界面, 取界面细胞至离心管内, 加PBS, 1 500 r/min离心5 min, 弃上清; 重复上述过程2次; 加培养液, 混匀, 显微镜下细胞计数, 调整细胞密度至2×109/L ; 接种细胞于24孔培养板中, 加入细胞因子Rat IL4（8 μg /L）、 Rat GMCSF（8 μg /L）, 培养箱中培养; 每天观察细胞形态变化并在第 3天半量换液, 并加入细胞因子继续培养, 于第5天吸取悬浮细胞和半贴壁细胞备用。 　　1.2.4 DC共培养 DC共培养分成 5组, 每组设3个复孔, 第1组为HepG2细胞对照, 第2组为DC阴性对照, 第 3组为LPS（脂多糖）, 第 4组空载体对照, 第 5组为重组41BBL HepG2细胞, 第1组、 第 4组和第 5组的HepG2细胞经80 mg/L丝裂霉素处理1 h后作为刺激细胞, 密度为2×105/孔, 第2组和第4组不加刺激细胞, 第 4组加入1.0 mg/L的LPS, 除第1组外其余各组均加入DC作为反应细胞, 密度为4×105/孔, 共培养在24孔板, 100 mL/L FCS、 37℃、 50 mL/L CO2条件下共同孵育48 h后收集细胞和培养上清备用。 　　1.2.5 DC细胞FCM表型和培养上清ELISA检测 细胞经PBS洗涤2次, 分别