金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染细胞病变及细胞周期的影响.docVIP

　　金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染细胞病变及细胞周期的影响 【关键词】 金叶败毒制剂； 人巨细胞病毒； 细胞病变； 细胞周期 　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of Jinye Baidu Preparation (JBP)，a Chinese medicinal preparation, on the cell pathological change and cell cycle of human embryonic lung fibroblast cells(HEL) infected by human cytomegalovirus (HCMV). MethodsThe HEL cells e icroscope before and after intervention of JBP and GCV. The cell cycle edicine by the Floeter. ResultsJBP shoan cytomegalovirus；Cell pathological change；Cell cycle 　　人巨细胞病毒（HCMV）是目前引起宫内感染的重要病原体之一，HCMV宫内传播与异常妊娠结局（流产、死胎、畸形、胎儿生长受限等）的发生关系密切，已成为影响胎儿发育的常见原因［1］。由于妊娠期HCMV感染尚无有效的 治疗 药物，本课题组在对金叶败毒制剂和巨细胞病毒感染的长期研究中发现，该中药制剂在体内外对HCMV均有明显的抑制作用［2，3］。本研究采用倒置相差显微镜动态观察感染细胞病变及流式细胞检测技术，探讨中药金叶败毒制剂对HCMV感染的人胚肺成纤维细胞（HEL）的细胞病变及细胞周期的影响，为临床用药提供实验依据。　 　 　1 材料与仪器 　　1.1 药物金叶败毒制剂主要成分为金银花、鱼腥草、大青叶及蒲公英等，20 ml/支，每毫升含生药量1 g，批号：950430，由同济 医院 中西医结合研究所提供,临用时用细胞维持液（含3%DMEM）稀释成不同浓度的溶液。更昔洛韦（简称GCV）粉针剂，25 mg/支，批号：950101，购自湖北省医学 工业 研究所,临用时用细胞维持液稀释成不同浓度的溶液。 　　1.2 细胞和病毒人胚肺成纤维细胞(HEL)由同济医院围产实验室提供,按常规方法培养、传代，制成单层细胞,第10～20代用于本实验。HCMV AD169标准毒株由湖北省病毒研究所提供，按常规方法传代、滴定,并测定半数组织培养感染量TCID50。 　　1.3 试剂及仪器高糖DMEM培养基，胰酶，胎牛血清等为Promega公司产品，碘化丙啶（PI）染色液为Sigma公司产品。 　　仪器： 流式细胞仪FACStar由美国BD公司提供。 　 　2 方法 　　2.1 病毒感染性滴度的测定胰蛋白酶消化收集HEL细胞，用10% DMEM培养液配制细胞悬液，0.4%台盼蓝染色后计数活细胞数，调整细胞浓度为 1×104个细胞/ml，接种于 96 孔细胞培养板内，0.2 ml/孔，待细胞长成单层后，同步化12 h；分别接种不同稀释度（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9）的AD169病毒，每个稀释度设8孔，每孔25 μl，37℃，5% CO2 培养箱吸附1.5 h后，弃上清，加维持液0.1 ml/孔，同时设细胞对照孔8孔；置37℃，5% CO2 培养箱培养，每日检查病毒生长情况，观察并记录特征性细胞病变（CPE）的孔数，7～28 d后记录结果。按Reed-Muench法［4］ 计算 病毒的半数感染量（TCID50）。 　　2.2 金叶败毒制剂对HCMV感染细胞病变的抑制作用以第10～20代HEL细胞为实验材料，接种于100 ml方培养瓶中，待细胞长成单层后，将100TCID50 的AD169毒株接种于培养瓶中，37℃吸附1.5 h后换液，病毒对照组更换维持液（DMEM-3%FCS）；药物实验组更换用维持液稀释的金叶败毒制剂,终浓度为4 mg/ml；药物对照组更换用维持液稀释的GCV, 终浓度为25 μg/ml。以上各药物及对照组均设3个实验瓶,倒置相差显微镜连续观察各组细胞病变，分别记录感染后12，24，48，72，96，120，144 h细胞病变情况。细胞病变分为: “-”为细胞无病变, “+”为1%～25%细胞病变, “++”为26%～50%细胞病变, “+++”为51%～75%细胞病变, “++++” 为76%～100%细胞病变。 　　2.3 流式细胞术检测细胞周期取第10～20代生长良好的HEL细胞，接种于100 ml方培养瓶中，待细胞长成单层后，同步化12 h。将100TCID50 的AD169毒株接种于培养