应用体外转录法和荧光素制备RNA探针的技术.pdfVIP

药 物 生 物 技 术 28 Pharmaceutical Biotechnology 2008，15(1)：28~30 应用体外转录法和荧光素制备RNA探针的技术 宁俊红，孙文夏，陈东戎 (复旦大学生物医学研究院药物与结构生物学研究所，上海200032) 摘 要 为建立一种快速制备RNA探针的方法，以研究不同的RNA与RNA之间的相互作用，介绍一种 用体外转录法制备RNA，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)纯化得到纯化的RNA，最后用荧光素标记得到 RNA探针的新方法，用该方法制备RNA探针简便、高效、安全，尤其适合小剂量RNA探针的制备。 关键词 体外转录法；荧光素；RNA探针；制备技术 中图分类号：Q7 文献标识码：A 文章编号：1005—8915(2008)01—0028—03 由于现代生物技术的高度发展，以RNA为对 1．3 2×标记反应缓冲液 象的研究与日俱增口q]，以RNA为作用靶点的药 加入 2O l 12．5mol／L的 1一甲基咪唑到 物开发也很多[4]，然而由于实验中的RNA含量很 7．5 ml的去离子水中，用2 mol／L NaOH调pH到 少，相对来说难以检测到RNA以及RNA与其它 8．5，然后加0．062 75 g EDAC到上述溶液中，最 物质的相互作用。该技术方法是利用一种荧光素 后加去离子水到1．0 ml。 标记RNA，以便检测和观察RNA与其它物质的 1．4 仪器 相互作用[ 引。此方法相对来说，更加简便、高效、 DNA合成仪，高效液相色谱仪、分光光度计、 安全、实用。反应后的混合物中包括荧光素、荧光 手提式紫外灯、高速离心机、可循环和控温的聚丙 素与RNA的结合物以及未反应的RNA，可以用 烯酰胺凝胶电泳仪。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或高效液相色谱 2 实验方法 (HPI C)来分离和纯化荧光素与RNA的结合物， 即RNA探针。 2．1 RNA的准备 ①根据所需的RNA设计DNA，用 DNA合 1 实验材料、试剂与仪器 成仪合成所需的DNA。 1．1 试剂 ②用体外转录试剂盒把DNA转录成RNA。 荧光素尸胺：5一((5一aminopenty1)thioureidy1) ③用1／10体积的3mol／L的NaC1和2．5倍 fluorescein，dihydrobromide salt(fluorescein ca— 体积的冷的无水乙醇沉淀，然后溶于1O l的去离 daverine)，RNA，1一甲基咪唑，二甲基亚砜：DM— 子水。 SO，乙基一二甲基胺一丙基碳化二亚胺：EDAC ④用相同体积的氯仿提取3次。 (ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide)，氯仿， ⑤ 再用 1／10体积的 3mol／L的 NaC1和 苯，异戊醇，无水乙醇，体外转录试剂盒，去磷酸化 2．5倍体积的冷的无水乙醇沉淀，然后溶于1O l 反应试剂盒，合成DNA的碱基。 的去离子水。 1．2 5×激酶反应缓冲液 如果此时的RNA含有一个5’一磷酸基团，则 250 mmol／L Tris—HC1，50 mmol／L MgC12， 直接进行标记，否则首先要做以下的实验： 25 mmol／L二硫苏糖醇，0．5 mmol／L亚精胺，