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【讨论】Trouble Shooting之酶切篇新】 - Welcome to DXY.CN Forum Welcome to DXY.CN Forum 论坛首页 | 全文搜索 | 电子期刊 | 个人属性 | 退出论坛 标记已读 | 我的论坛 | 我的简历 | 帖子收藏 | 论坛帮助 » Welcome to DXY.CN Forum » 生物化学与分子生物学讨论版 » 实验交流 打印话题 寄给朋友 【讨论】Trouble Shooting之酶切篇新】 [精华] JeepMax 2007-04-19 13:15 在进行酶切或酶切出现问题时 ，我个人觉得应该看看内切酶的说明书和相应的试剂公司的目录 ，通常，不 丁香园准中级站友 同公司出产的内切酶，它的菌株来源、制备工艺、纯度及活力、酶切活性的优化等都可能存在不同，试剂 发贴: 156 公司会对 自己的内切酶进行比较全面的分析，因此，说明书及目录中的技术资料是最具有针对性的资料。 积分: 55 我们可以在上面找到酶的单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等] 、酶切反应温 度[有些酶是在50 、55或30等温度下反应的] 、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活性的可 得票: 16 能因素、保护性碱基问题等等，此外，我们还可以比较便捷地找到同尾酶、同裂酶等信息。这些可以提高 状态: 离线 我们对内切酶的认识 ，减少出现问题的可能。 在酶切实验中，还会出现其它一些问题 ，这些问题可能具有普遍性，至少在我身上出现过 ，因此整理了一 些问题 ，希望对大家有用，同时感谢amberly 、wht5945等战友的热情讨论和支持及斑竹的加分鼓励 ，同 时希望战友们能够分享自己的经验 ，共同将trouble shooting完善，THANKS ！ 1. 酶切不开或酶切不完全 1.1 质粒 问题 ：酶切不开或酶切不完全，质粒的纯度差或残留酶切抑制物的可能是最为常见的问题 。质粒 纯度不够，一些杂蛋白的存在会影响酶切反应 ，通常表现为A260/A280的比值低于1.8 ；质粒提取时有酶 切抑制物的残留，常见的有酚、盐 、乙醇等；【建议重新提取DNA ，使用可靠的试剂盒，或可靠的手工提 取试剂 ，具体可参考帖子 /bbs/post/view?bid=154id=8763856sty=1tpg=1age=0 其它建议还请战友多多补充，谢谢 。】 1.2 酶的 问题 ：确认内切酶是有效的 [很多 内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，我们可 以继续使用。同样，如果确认酶切效果不好，就要做好标记 ，更换内切酶] 。 【题外话 ：使用内切酶的注意事项】 a. 内切酶如无特殊要求，应该保存在-20~-30度。温度也并非越低越好，由于酶通常是保存在50％的甘油 缓冲液中，温度过低时 ，酶会发生冻结 （运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用 干冰，酶会冻结 ，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择 ），如果是经常使用的话 ，酶会被反复冻 融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。