影响籼粳稻DNA限制性片段长度多态性检测的因素分析灞.PDF

遗 传 学 报，20(5):455-4613,1993 ActaGeneticaSinica 影响釉粳稻DNA 限制性片段长度 多态性检测的因素分析＊ 吴志浩 徐云碧1)朱立煌 （中国科学院遗传研究所植物生物技术实验室，北京 100101) 对窄叶青 （釉稻）和京系17(粳稻）的RFLP进行了系统分析。结果表1}‘15某种酶多态性 检测能力与同时检测到此多态性的其余酶的数目之间存在极显著的正相关．r（二。.962Xcale), 由此推论，釉粳稻大部分 RFLP可能来自大范围DNA的结构变化而不是碱基取代。cDNA 克隆虽然具有高度的保守性，但却具有比基因组克隆更高的多态性检测能力。在实验使用的 探针范围内，探针长度和检测到的多态性无相关性。由探针检测到的多态性位点均匀地散布 在水稻的12对染色体上，这可能是这两个品种所属的亚种之间的遗传距离较大的原因。 关键词 RFLP，基因组克隆，cDNA克隆 由限制性内切酶揭示的在 DNA水平上的限制性片段长度多态性 R（FLP）已被广 泛用来作为分子标记，构建各种生物的 R（FLP）遗传连锁图。饱和的RFLP连锁图是 基因组研究的基础，也是新的基因克隆技术的依据。为了饱和 RFLP图谱，需要开发更＿ 多的分子标记。从理论上说，可供定位的分子标记的多寡取决于两亲的遗传距离，但在实 际测定时，一些生化因素，如限制性内切酶的种类，分子探针的来源均与可能被检测的多 态性程度有密切的关系。Miller和 Tanksley[51曾以番茄为对象对这类关系进行过详细 的研究。我们实验室为了构建1个永久性的水稻 RFLP作图群体，对1对釉粳稻 （窄叶 青／京系17）的RFLP进行了比较系统的研究。按照已发表的水稻 RFLP图谱(41，我们， 共用了161.个分子标记，8种限制性内切酶对窄叶青和京系 17迸行 RFLP测定。本文提 供有关 RFLP的研究数据，并通过对数据的处理和分析，探讨形成 RFLP的可能机制。 材 料 和 方 法 一（）水稻DNA 的提取 将水稻叶片在液氮中研磨成粉末状，与65`-C预热的尿素／酚抽提缓冲液 4（2%尿素、 5molLNaCI,1mo1/LTris-HCIpH8.0,0.25mo1/LEDTA,5%Sarkosyl和 5%酚） 混匀，加人SDS至0.6外,65℃保温30分钟。用氯仿／异戊醇 (24:1)抽提去蛋白，氯仿抽是 可重复二、三次。离心收集上清液，用2倍无水乙醇沉淀，溶解于TE[10mmol/LTris- HCI,lmmol/LEDTA(pH8.0)]中。上清液加入 RNase至终浓1义为1ogglml，再用 本文于1992年4月3日收到。 ．术研究受美国洛克菲勒基金会的资助。 l)浙江农业大学农学系，杭州 310029, 456 遗 传 学 报 20卷 乙醇沉淀，最后溶解于适量 TE中。 二（）质粒 DNA 提取 按照 Wilimzig183的氯化锉煮法提取。 161个水鹤 RFLP标记克降均 由美围 ,Cornell大学的 Tanksley实验室提供。 水稻 DNA 插人片段小于3.5i,.1),载体为 pUC8和 pGEM4。使用卤株为 E.coilDpi,-alpha,, 三（）限制性内切酶 在实验中使用的8种限制性内切酶是：EcoRI,EcoRV,HindIII,Scal,Xbal, BamH1和 Bgr11西（德 Boehringer公司和中国华美公司）。酶解条件按产品说明进行，（ 为使酶解完全，在反应液中加人了亚精胺 (immol/L）和苏二糖醇 (5mmol/L)。反应时 伺均为8小时以上。 （四）电泳及Southern吸印 电泳琼脂糖凝胶的浓度为0.8务。 电泳样品的DNA含量为45ng。 电压不超过 -40伏，电泳时间为16小时以上。Southern吸印使用HybondN＋尼龙膜 (Amersham 产品），吸印按产品说明书进行，吸印溶液为0.4mol/LNaOH，时间为3小时以上。吸印 后．溶液在2XSSC溶液漂