第五章_毛细管凝胶电泳.ppt

* * 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis) 讲解人：操兰 学号：2015110239 Contents 1 发展简史 2 毛细管凝胶电泳的原理 3 毛细管凝胶柱的制备技术 4 现有交联凝胶柱制备技术 5 凝胶缺陷的形成原因和避免措施 6 毛细管凝胶电泳的应用 7 CGE 技术的问题与展望 8 相关文献 一、发展简介 1.早在六十年代 ,Hjerten就尝试过毛细管电泳技术 , 在七十年代 Virtanen和 Mikkers等人 也进行过研究 。 由于受到检测器灵敏度的限制 , 不能用细内径的毛细管,电泳过程中产生的焦耳热不能很好地散失 , 以致限制了高电压的运用 ,严重影响了分离效率。 2.七十年代末 ,毛细管技术的广泛应用 , 使得人们加快了对细管电泳的研究 。1951年 , Jorgensen等人改善了检测器的灵敏度 , 可以使用75um 内径的玻璃毛细管 , 并采用了30kV的高压 , 获得了很高的效率 ( N=4x105s ) 。他们对毛细管电泳分离理论的研究以 及柱效方程的推导 , 对毛细管电泳技术的发展起了巨大的推动作用。 3.1983年hierten首次将传统凝胶电泳技术中的聚丙烯酞凝胶装入150um 的玻璃毛细管 , 以消除毛细管内壁对蛋白质的吸附 , 并利用这种方法对多种蛋白质进行了分离 ,取得了很好的分离效果 。1957年 ,oChen 和Karger使用了100um 内径以下的弹性石英毛细管 , 用同管内壁交联的方法制备凝胶柱,分离了蛋白质 、DNA和寡聚核昔酸 。 4.1990 年 , Lux和Yin 等人对 oChen和Karger柱制备技术进行了改进 , 提出了用线性聚丙烯酞胺对柱内表面预处理和用γ射线引发聚合的方法 , 在分离DNA内切片段和寡聚核昔酸时取得极好的效率。 二、基本原理 毛细管凝胶电泳 (CGE) 是毛细管电泳的几种操作模式之一, 特别适于分离蛋白质、核酸片段等生物大分子, 具有分离能力强、速度快等特点。 毛细管凝胶电泳,是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用,溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大,能减少溶质的扩散,所得峰形尖锐,能达到最高的柱效。常用聚丙烯酞胺在毛细管内交联制成凝胶柱,可分离测定蛋白质和的分子量或碱基数,但其制备麻烦,使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酞胺,可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分介质，它能避免空泡形成,比凝胶柱制备简单,寿命长,但分离能力比凝胶柱略差。 22－毛细管凝胶电泳 用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的体积大小和组分的质荷比来进行分离 ,大分子出来的快，小分子出来的慢。 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）：以丙烯酰胺为单体，甲叉双丙烯酰胺作为交联剂，由过硫酸铵与四甲基乙二胺为氧化还原反应产生的自由基催化聚合而成。PAG的孔径一般在3－30nm左右，适合分离核酸片段结构。 琼脂糖凝胶（AG）：由琼脂糖在氢键作用下结合而成，孔径大，常用来分离蛋白质分子和大的DNA片段。 凝胶的种类 CH2=CH CO NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH CH2=CH C=O 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点： 1.电泳峰尖锐，柱效极高 2.短柱上实现极好的分离 3.试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短。 已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。 22－2 分离模毛细管凝胶电泳 三、毛细管凝胶柱制备技术 毛细管凝胶柱的性能指标 (1) 柱稳定性 (即柱寿命) , 这是评价毛细管凝胶柱的一个重要指标, 各种柱制备方法都力求提高柱稳定性, 没有高的稳定性, 就没有迁移时间和峰面积的高度重现性; (2) 柱分离效率; (3) 迁移时间的重现性 (在DNA 序列分析中尤其重要)。 在毛细管中制备聚丙烯酰胺凝胶通常包括以下几步操作: (1) 毛细管内壁的处理 a) 用有机溶剂、碱液、水清洗毛细管内壁; b) 在毛细管内壁键合双官能团试剂 (如MAPS) ; c) 使双官能团试剂与单体聚合形成一层聚合物薄膜。 根据需要, 有时可以省去操作 c 或者操作 b和 c。 (2) 预聚溶液的准备 (包