酶处理染色质免疫沉淀磁珠式操作方法所需试剂包含在试剂盒.DOC

“酶”处理染色质免疫沉淀(磁珠式)操作方法 所需试剂 包含在试剂盒 SimpleChIP? Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003:中的试剂： 甘氨酸溶液 (10X) 缓冲液 A (4X) 缓冲液 B (4X) ChIP缓冲液 (10X) ChIP 洗脱（缓冲）液 (2X) 5 M NaCl 0.5 M EDTA 1M DTT 结合（缓冲）液 漂洗（缓冲）液 洗脱（缓冲）液 DNA纯化柱 蛋白酶混合抑制剂 (200X) 核糖核酸酶A (10 mg/ml) 微球菌核酸酶 (2000 gel units/μl): NEB #M0247S 蛋白酶K (20 mg/ml): NEB #P8102S SimpleChIP? 人 RPL30 外显子3引物 SimpleChIP? 人 RPL30 内含子2引物 组蛋白H3 (D2B12) XP? 兔单抗 (ChIP 专用) #4620 正常兔IgG #2729 ChIP级蛋白G磁珠 #9006 不包含在试剂盒SimpleChIP? Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003中的试剂： 六管磁性分离架 #7017 PMSF (0.1 M ,溶剂乙醇) 甲醛（37%）（福尔马林） 乙醇（96-100%） 1X PBS 无核酸酶的水 Taq DNA聚合酶 dNTP 混合液 体内交联，细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质 开始之前： 每次实验需要刺激或处理大约4X 107个细胞。这些细胞中提取的染色质可以用于多达10次单独的免疫沉淀实验。 以Hela细胞为例，这相当于5个15 cm培养皿中细胞密度达到90%时的总细胞数（一般每个盘中的培养基为20 ml）。 另外准备一盘细胞用于血球计数板法测定细胞数。 取出并需预热的试剂： 200X蛋白酶混合抑制剂 1 M的二硫苏糖醇 0.1 M PMSF （自备） 10X ChIP缓冲液（使用前请确认SDS已完全溶解）。 为每4 X 107细胞准备以下试剂，并在冰上预冷（5个培养皿）： 10 ml 10X 甘氨酸溶液 200 ml 1X PBS（自备） 10 ml 1X PBS + 100 μl PMSF 10 ml 1X 缓冲液 A （2.5 ml 4X缓冲液 A + 7.5 ml 水） + 5 μl 1 M DTT + 50 μl 200X 蛋白酶混合抑制剂l （PIC） + 100 μl PMSF 11 ml 1X 缓冲液 B （2.75 ml 4X 缓冲液 B + 8.25 ml 水） + 5.5 μl 1 M DTT 1 ml 1X ChIP 缓冲液 （100 μl 10X ChIP 缓冲液 + 900 μl 水） + 5 μl 200X 蛋白酶混合抑制剂 （PIC） + 10 μl PMSF. 为了使蛋白与DNA交联，向每个含有20 ml培养基的15cm培养皿中加入540 μl 37%的甲醛溶液。稍加转动培养皿使之混匀，室温放置10分钟。 甲醛的终浓度为 1%. 使用新鲜未过产品保质期的甲醛溶液 加入甲醛后，培养基的颜色会发生改变。 每个盘中加入2 ml 10X 甘氨酸溶液稍加转动使之混匀，室温孵育5分钟。 加入甘氨酸后，培养基的颜色会发生改变。 对于贴壁细胞，弃去培养基后用冰冷的PBS漂洗两次（20 ml /次），彻底弃净PBS。对于悬浮细胞，4℃ 1500rpm离心5分钟，沉淀用冰冷的PBS漂洗两次。 每盘细胞中加入2 ml冰冷的1X PBS + PMSF，将细胞刮下并将5盘细胞收集到一个15 ml的锥底管中。悬浮细胞直接将细胞重悬到2 ml的冰冷缓冲液中合并即可。 4°C 1500rpm离心5分钟。弃上清，并将细胞重悬在10 ml冰冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF中。冰上孵育10分钟。每3分钟颠倒混匀一次。 4°C 3000rpm离心5分钟以沉淀细胞核。弃上清，并将沉淀重悬在10 ml冰冷的缓冲液B + DTT中。再次离心，弃上清，并将沉淀重悬在1.0 ml 缓冲液 B + DTT中。将样品转移到1.5 ml离心管中。 加入5 μl微球菌核酸酶，颠倒混匀数次，37°C孵育20 min，每隔3~5分钟颠倒混匀一次，将DNA消化成长度约为150-900 bp的片段。 需要做预实验确定将不同细胞系DNA酶切到理想长度所需微球菌核酸酶的酶量（参照附录A）。 4 X 107个HeLa细胞核用5 μl微球菌核酸酶在1 ml缓冲液 B + DTT中消化可以得到合适长度的DNA片段。 加入100 μl 0.5 M EDTA终止消化，将离心管置于冰上。 4°C 13000rpm离心1分钟，沉淀细胞核。弃